芍藥苷對(duì)大鼠術(shù)后腸粘連影響及其作用機(jī)制探討

常 琦 劉 濤 張 磊 高 琪

術(shù)后腸粘連是腹腔手術(shù)后最為常見(jiàn)的并發(fā)癥，發(fā)生率約93%[1]。腸粘連最常見(jiàn)的并發(fā)癥是腸梗阻，其次會(huì)引起育齡婦女不育。目前預(yù)防術(shù)后腸粘連形成的藥物或材料較多，如各種形式的膜類(lèi)材料、粘性膠和腹膜內(nèi)溶液類(lèi)及中藥制劑等。但是能有效地預(yù)防術(shù)后腸粘連形成的材料仍然缺乏[2]。研究[3]顯示,芍藥苷可通過(guò)降低炎癥反應(yīng)而減輕關(guān)節(jié)炎，故本研究通過(guò)構(gòu)建腸粘連模型，評(píng)估粘連形成結(jié)局，檢測(cè)術(shù)后的轉(zhuǎn)化因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、白介素-8(interleukin 8，IL-8)的表達(dá)量，明確芍藥苷是否可通過(guò)降低炎癥反應(yīng)減輕術(shù)后粘連形成，為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 選取健康雄性大鼠40只，3周齡，體質(zhì)量為(130.00±10.00)g(購(gòu)于延安大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；TGF-β、IL-8 ELISA試劑盒購(gòu)自武漢建成生物科技公司；TGF-β、IL-8抗體購(gòu)自Sigma公司購(gòu)買(mǎi)；明質(zhì)酸鈉鹽購(gòu)自上海華源生命科學(xué)研究開(kāi)發(fā)有限公司；芍藥苷購(gòu)自上海麥克林生物科技公司；其余實(shí)驗(yàn)器材均共享自延安大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 采用電腦編號(hào)隨機(jī)抽取大鼠，分為空白對(duì)照(Sham)組、對(duì)照組(Control)組、透明質(zhì)酸鈉鹽(Hyaluronate)陽(yáng)性對(duì)照組(HA組)以及芍藥苷組(Paeoniflorin)4個(gè)組；每組大鼠為10只。

1.2.2 造模及給藥 術(shù)前3天將4組動(dòng)物放入飼養(yǎng)室中，使動(dòng)物習(xí)慣飼養(yǎng)環(huán)境，手術(shù)前晚禁食不禁水；采用戊巴比妥麻醉，麻醉劑量為40 mg/kg，麻醉后所有動(dòng)物剃毛消毒，無(wú)菌下進(jìn)行手術(shù)。Sham組正常開(kāi)腹后找到盲腸向外拉出然后放回；其余3組均參照李培寧教授[4]的盲腸摩擦+對(duì)應(yīng)腹壁損傷模型進(jìn)行腸粘連造模，即進(jìn)行盲腸無(wú)菌濕紗布摩擦，均勻摩擦致漿膜破損出現(xiàn)微小出血點(diǎn)；對(duì)應(yīng)腹壁使用手術(shù)刀片刮損直至壁層腹膜破損。HA組完成造模后于摩擦面給予HA 10 mg(濃度為10 mg/mL)。造模完成后逐層關(guān)閉腹腔。芍藥苷組造模完成后麻醉清醒即通過(guò)灌胃給予60 mg/(kg·d)芍藥苷。芍藥苷的給藥劑量與方式, 參照文獻(xiàn)[5-6]并結(jié)合芍藥苷毒理學(xué)劑量。

1.3 觀察指標(biāo) 構(gòu)建大鼠模型后第10天二次剖腹，按照Evans[5]的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組粘連進(jìn)行分級(jí)后并評(píng)分；通過(guò)病理分析各組炎癥滲出情況；比較各組GF-β、IL-8的表達(dá)水平。

1.3.1 粘連評(píng)分及標(biāo)本采集 術(shù)后第10天，采取U型開(kāi)腹，觀察粘連形成情況。由2位非直接參與實(shí)驗(yàn)人員參照文獻(xiàn)[5]對(duì)粘連進(jìn)行分級(jí)后并評(píng)分。0分:無(wú)粘連;1分:1 ～ 2處輕微粘連, 輕拉即開(kāi);2 分:2處以上粘連, 尚能分離,分離后不留痕跡;3分:多處粘連, 較難分離或粘連雖不多, 但不能分離;4 分:粘連成團(tuán), 不能分離。評(píng)分完畢后進(jìn)行粘連標(biāo)本采集，將標(biāo)本直接放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆茫蝗「怪鲃?dòng)脈血用于檢測(cè)細(xì)胞因子。

1.3.2 病理學(xué)分析炎癥滲出 常規(guī)石蠟切片HE染色,光鏡觀察粘連組織中炎癥細(xì)胞等病理參數(shù)的變化情況；每只大鼠粘連組織切5張切片，隨機(jī)選取2張切片，其中每張切片隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野(20×10)進(jìn)行評(píng)分，參照Saber法[6]對(duì)每只大鼠切片進(jìn)行評(píng)分。炎癥評(píng)分：1分，無(wú)炎癥反應(yīng)細(xì)胞；2分，鏡下可見(jiàn)巨核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞；3分，鏡下可見(jiàn)巨核細(xì)胞、漿細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和中性粒細(xì)胞；4分，鏡下可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和微小膿腫形成。纖維形成評(píng)分：0分，無(wú)纖維形成；1分，輕度纖維形成；2分，中度纖維形成；3分嚴(yán)重纖維形成。

1.3.3. TGF-β、IL-8的表達(dá) 采用蛋白質(zhì)印跡(Western blot)定量分析TGF-β、IL-8的表達(dá)。取粘連組織40 mg充分研磨，RIPA裂解后常規(guī)使用BCA法蛋白定量。根據(jù)蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線統(tǒng)一上樣量為40 μg，其他凝膠配置及溶液配置均參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。設(shè)置電壓濃縮膠：75 V 30 min；分離膠恒壓110 V 1.5 h；一抗TGF-β濃度為1∶800、IL-8濃度為1∶500；最后進(jìn)行Image Lab(美國(guó))發(fā)光、圖像采集及數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠術(shù)后腸粘連的分級(jí)及評(píng)分比較 術(shù)后第10天，肉眼觀察Control組大鼠有大量的腸粘連出現(xiàn)，創(chuàng)面與小腸、腹壁間粘連廣泛，粘連組織致密，難以分開(kāi)；Sham組中傷口周?chē)胁糠帜c粘連，無(wú)其他粘連；HA與Paeoniflorin(芍藥苷)組腸粘連顯著減少，而Paeoniflorin組腸粘連較HA組較少(見(jiàn)圖1)。Control組大鼠粘連等級(jí)都在3～4級(jí)，平均評(píng)分為(3.43±0.35)分；Sham組粘連等級(jí)在1～2級(jí)，平均評(píng)分為(1.33±0.41)分；HA組中粘連等級(jí)在2～3之間，評(píng)分為(2.13±0.61)分；芍藥苷組中粘連等級(jí)為1～2級(jí)，平均評(píng)分為(1.81±0.44)分,與Control組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見(jiàn)圖2。

圖1 術(shù)后各組大鼠腸粘連情況對(duì)比

圖2 術(shù)后各組粘連的評(píng)分

注：A為術(shù)后粘連等級(jí)圖；B為術(shù)后粘連評(píng)分圖；*本組與Control組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

2.2 4組大鼠炎癥滲出比較 通過(guò)病理分析各組大鼠炎癥滲出，結(jié)果顯示Control組粘連組織中有大量的炎癥細(xì)胞滲出，有新生的毛細(xì)血管產(chǎn)生；在Sham組中無(wú)炎癥細(xì)胞滲出；在HA組中炎癥細(xì)胞中等滲出；Paeoniflorin組中炎癥較Control組顯著降低，并且優(yōu)于HA組，詳見(jiàn)圖3、4。

2.3 TGF-β、IL-8的表達(dá)水平及定量分析 采用ELISA檢測(cè)TGF-β、IL-8的表達(dá)，結(jié)果顯示Paeoniflorin組中TGF-β、IL-8的表達(dá)水平明顯降低，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見(jiàn)圖5。采用Western blot定量分析TGF-β、IL-8水平，結(jié)果顯示在Paeoniflorin組中TGF-β、IL-8的表達(dá)水平降低，與血中TGF-β、IL-8的表達(dá)結(jié)果一致，詳見(jiàn)圖6。

圖3 術(shù)后各組炎癥病理(HE×200)

圖4 術(shù)后各組HE染色炎癥評(píng)分

注： *表示與對(duì)照比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

圖5 ELISA分析術(shù)后炎癥因子TGF-β與IL-8

注：A為術(shù)后各組GTF-β含量的變化；B為術(shù)后各組IL-8含量變化。*與對(duì)照比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

圖6 Western blotting定量分析炎癥因子TGF-β與IL-8

3 討論

腹膜間皮細(xì)胞受損后其修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程。當(dāng)敏感的間皮細(xì)胞受到打擊或局部手術(shù)創(chuàng)傷后則有一系列血管反應(yīng)事件隨之而來(lái)，最終導(dǎo)致炎癥和組織修復(fù)[7]。在創(chuàng)傷愈合中炎癥細(xì)胞因子在纖維蛋白沉積和降解的平衡中是至關(guān)重要的。炎癥細(xì)胞因子的總體作用是改變纖維蛋白沉積和降解的平衡，并有利于纖維形成，其中TGF-β以及IL-8在此過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

TGF-β是一種強(qiáng)效的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)、啟動(dòng)以及終止組織修復(fù)的作用[8-9]。在粘連的形成中，無(wú)論是在動(dòng)物模型還是體外實(shí)驗(yàn)，TGF-β是目前研究較為明確的炎癥細(xì)胞因子之一。研究[10-11]顯示，在動(dòng)物模型中,術(shù)后創(chuàng)面使用重組TGF-β試劑后，粘連顯著增加；使用TGF-β抑制劑后粘連顯著降低。手術(shù)創(chuàng)傷后TGF-β受體在腹膜組織以及腹膜積液中顯著升高。TGF-β過(guò)度表達(dá)可直接致組織纖維化，促進(jìn)纖維粘連的轉(zhuǎn)化[8]。因此，可能會(huì)降低早期纖維素滲出的溶解能力，最終導(dǎo)致纖維堆積及膠原沉積促進(jìn)粘連形成。由此可見(jiàn)，TGF-β是主要的纖維蛋白溶解抑制劑以及纖溶酶原激活物抑制劑。因此，通過(guò)抑制TGF-β表達(dá)則可促進(jìn)纖維溶解，降低膠原沉積，最終減輕腸粘連的形成。

IL-8由腹膜間皮分泌，是炎癥細(xì)胞高度選擇性趨化因子[12]，可以激活嗜中性粒細(xì)胞脫粒。受損的間皮細(xì)胞分泌IL-8后促進(jìn)炎癥細(xì)胞的進(jìn)一步聚集[13]。間皮細(xì)胞分泌IL-8后可刺激TNF- α和IL-1的分泌，升高的TNF- α具有較強(qiáng)的抑制腹膜纖溶活性。與無(wú)胃腸道穿孔的患者相比，有穿孔患者其腹腔液中IL-8濃度在手術(shù)時(shí)增加100倍[14-15]。IL-8在術(shù)后粘連形成的作用的具體機(jī)制仍不清楚，可能是通過(guò)升高TNF- α及炎癥滲出促進(jìn)纖維形成最終導(dǎo)致粘連形成。

此外，中醫(yī)藥的理論在調(diào)理術(shù)后機(jī)體胃腸道功能及抑制術(shù)后腹腔粘連方面具有確切的療效,越來(lái)越多的理念被引入術(shù)后康復(fù)中[16]。芍藥同時(shí)具有活血祛瘀作用,可改善腸壁循環(huán),促進(jìn)腸壁水腫消退和粘連吸收, 增強(qiáng)腸蠕動(dòng)，從而減少創(chuàng)面間的接觸時(shí)間，降低了創(chuàng)面間的纖維沉積。

本實(shí)驗(yàn)顯示，芍藥苷顯著降低了TGF-β、IL-8表達(dá)水平，使用芍藥苷后粘連組織炎癥滲出、粘連程度明顯低于模型對(duì)照組, 說(shuō)明芍藥苷對(duì)TGF-β、IL-8的表達(dá)具有抑制效果，具有良好的抗炎效應(yīng)，從而減輕術(shù)后粘連的形成。TGF-β、IL-8的高表達(dá)與纖溶抑制以及纖維形成緊密相關(guān)，本研究顯示，術(shù)后使用芍藥苷粘連形成明顯減少，實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后粘連組織中的TGF-β、IL-8表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。表明芍藥苷預(yù)防大鼠術(shù)后腸粘連的作用機(jī)制可能是抑制TGF-β、IL-8的過(guò)度表達(dá)、降低纖維蛋白的形成、促進(jìn)纖溶活性、減少膠原沉積，最終發(fā)揮減輕術(shù)后腸粘連的作用效果。

綜上所述，術(shù)后使用芍藥苷可能通過(guò)降低炎癥反應(yīng)與纖維形成致膠原過(guò)度沉積，進(jìn)而減輕術(shù)后腹腔粘連的形成，芍藥苷將有望成為預(yù)防腹腔粘連的新方向。