Cu2+脅迫對生菜種子萌發(fā)和幼苗生理特性的影響

武玉珍，閆 芳

（晉中學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山西晉中030619）

隨著城市建設(shè)和工業(yè)發(fā)展的快速推進，金屬礦山被大量開采發(fā)掘，導(dǎo)致環(huán)境問題日益加重，重金屬污染和監(jiān)測得到了廣泛關(guān)注，而銅污染是當(dāng)前土壤、河流污染中較為突出的問題[1]。并且泥土、植物中的重金屬離子，很難被微生物等降解，所以在泥土、植物內(nèi)重金屬離子得以積累，當(dāng)積累到一定量時，就會威脅植物的生長，并且危及到人類健康，甚至影響整個生態(tài)系統(tǒng)的正常運轉(zhuǎn)[2]。銅是高等植物生長、發(fā)育所必需的微量元素之一，它參與多種植物生理代謝過程，對植物的生長、發(fā)育等具有重要作用；但過多的銅對植物有毒害作用，會造成種子萌發(fā)過程中氧化還原作用失控，引起植物萌發(fā)障礙[3]。

生菜（Lactuca sativa）俗稱葉用萵苣，或稱鵝仔菜、萵仔菜等，屬菊科萵苣屬，是人們的日常生活中很好的一種綠葉蔬菜。田丹等[4]研究了重金屬Cd2+對生菜種子萌發(fā)和幼苗抗氧化酶系統(tǒng)的影響，結(jié)果表明，在低濃度Cd2+作用下，生菜種子萌發(fā)受抑制不明顯，在高濃度Cd2+作用下，生菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均呈下降趨勢，同時較高濃度的Cd2+對生菜幼苗根和芽的生長情況、保護酶的活性也具有明顯的抑制作用。程貫召[5]在2008年研究了Cu2+脅迫下小麥種子萌發(fā)和幼苗的生長狀況，結(jié)果表明，Cu2+脅迫對小麥種子萌發(fā)的影響很大，隨著Cu2+濃度的升高，小麥種子萌發(fā)率逐漸降低，且二者呈極顯著負(fù)相關(guān)，高濃度抑制效應(yīng)比較突出。黎建玲等[6]研究了在Cu2+作用下，南瓜種子萌發(fā)和幼苗生長狀況，結(jié)果表明，在低濃度Cu2+作用下，與CK相比，南瓜種子萌發(fā)快，在高濃度的Cu2+作用下，與CK相比，南瓜種子萌發(fā)率明顯下降。章家恩等[7]運用了2層濾紙和重復(fù)對照3次以及控制作用因子的方法，研究了在Ni2+，Cu2+的脅迫下，5種植物種子萌發(fā)、幼苗生長的狀況，結(jié)果呈現(xiàn)出協(xié)同作用的趨勢。但是，目前，Cu2+脅迫對生菜種子萌發(fā)和幼苗生長的影響還未見報道。

本研究通過水培試驗，研究不同質(zhì)量濃度Cu2+溶液對生菜種子萌發(fā)及幼苗生長的影響，旨在為生菜育種和種植過程中避免過量的Cu2+的傷害提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試生菜品種為大速生菜（Lactuca sativa），購自河北滄州科力豐種苗有限責(zé)任公司。

1.2 試驗方法

選取年份相同、飽滿度較好、完整且大小一致無霉變的大速生菜種子1 050粒。于實驗室中用0.5%的次氯酸鈉溶液浸泡30 min消毒，并用玻璃棒攪拌，然后用蒸餾水沖洗多次，用濾紙吸干水分，備用培養(yǎng)[8]。CuSO4溶液濃度梯度設(shè)置為 0（CK），5，10，20，50，80，120 mg/L。每個培養(yǎng)皿中放置 2 層濾紙，并在濾紙上放入生菜種子50粒，貼上標(biāo)簽備用（標(biāo)簽注明CuSO4溶液濃度及編號）。首次添加25mL培養(yǎng)液，定期向各處理培養(yǎng)皿中加入等體積的溶液，以保證各培養(yǎng)皿的水分條件和CuSO4溶液濃度恒定，設(shè)定周期溫度、光照在恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行周期培養(yǎng)[9-10]。

1.2.1 不同濃度CuSO4溶液對生菜種子萌發(fā)情況的影響 從第1天培養(yǎng)開始，每天15：00定時觀察是否有小白尖狀的芽伸出，并及時補充水分，記錄測量并匯總各培養(yǎng)皿的出芽情況。

式中，Gt為生菜種子在t天內(nèi)的發(fā)芽數(shù)，Dt為相對應(yīng)發(fā)芽天數(shù)[11]。

1.2.2 不同濃度CuSO4溶液對生菜幼苗形態(tài)的影響 將剛發(fā)芽的大速生菜種子培育10 d后，對幼苗的株高、根長、可見葉片數(shù)進行觀察測量。其中，從每組中各選45株生長良好的幼苗，用細(xì)線法測量株高，求平均值并記錄；從每組中各選45條最長的根，用細(xì)線法測量根長，求平均值并記錄；觀察并記錄可見葉片數(shù)。

1.2.3 不同濃度CuSO4溶液對生菜幼苗葉綠素含量的影響 當(dāng)生菜幼苗長到4片葉子時，從每組分別選出具有代表性長勢良好的葉片作為檢測葉綠素含量的試驗材料，共7組。

葉綠素含量的測定：把供試生菜幼苗葉片清洗干凈，剪掉葉脈。稱取葉片0.2 g，放入研缽中，加入少許石英砂和3 mL無水乙醇，研成均漿，加入乙醇10 mL，繼續(xù)研磨，直至看到葉片組織顏色變白。靜置3～5 min。剪取1張圓形濾紙，放入漏斗內(nèi)并用乙醇潤濕，將研缽中的液體倒入漏斗，用少量乙醇沖洗研缽、研棒和殘渣數(shù)次，最后連同殘渣一起倒入漏斗中；用滴管吸取乙醇，多次沖洗濾紙上的葉綠素，直至濾紙和殘渣變?yōu)榘咨?。用乙醇定容?00 mL，搖勻，靜置備用。最后用分光光度計測量其在波長665，645 nm下的吸光度，以95%乙醇為空白對照調(diào)透光率為100%[12]。

式中，Ca為葉綠素a的質(zhì)量濃度（mg/L）；Cb為葉綠素b的質(zhì)量濃度（mg/L）；CT為總?cè)~綠素的質(zhì)量濃度（mg/L）。

式中，C為色素質(zhì)量濃度（mg/L）；V為提取液總量（L）；N 為稀釋倍數(shù)；W為葉片鮮質(zhì)量（g）。

1.2.4 不同濃度CuSO4溶液對生菜幼苗SOD活性的影響（氮藍四唑法） 稱取0.6 g長勢良好的生菜葉片，洗凈、剪碎，置于研缽中（研缽提前預(yù)冷），滴入2 mL 0.05 mol/L的pH值為7.8的磷酸緩沖液，進行研磨，使葉片組織、細(xì)胞破碎，SOD充分溶解到緩沖液中，繼續(xù)加緩沖液使最終體積為10 mL，然后取5mL用離心機于4℃，4000r/min離心15min，得到的提取液即為SOD粗酶液。然后取25 mL玻璃管2支，編號為1號、2號管，其中，1號為對照管，1號管滴入5 mL NBT溶液；2號管滴入5 mL NBT和100 μL粗酶液，混勻。將2個試管置于4 000 lx日光下，反應(yīng)20 min（反應(yīng)時，各管受光情況要一致，反應(yīng)溫度要控制在25～35℃）。反應(yīng)結(jié)束后，以未光照的對照管為空白對照，測定1號、2號管的吸光度[13]。

式中，SOD為活性，以每g鮮質(zhì)量酶單位表示；AS為樣品管的吸光度；VT為樣液總體積（mL）；VS為測定時，生菜葉片的用量（mL）；W為生菜葉片的鮮質(zhì)量（g）；A0為未光照對照管的吸光度。

1.2.5 不同濃度CuSO4溶液對生菜幼苗POD活性的影響 稱取生長良好的生菜幼苗葉片0.15 g，研成勻漿，在轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心15 min后，提取上清液，余下殘渣二次提取，2次所得合并后即為粗酶液。加入0.05 mol/L的磷酸緩沖液2.9 mL，2%的 H2O21.0 mL，0.05 mol/L愈創(chuàng)木酚和 0.1 mL酶液。用加熱煮沸5 min的酶液作對照，加入酶液后的反應(yīng)體系，立即在34℃水浴中保溫3 min，迅速稀釋1倍，取2支玻璃比色皿，其中一支加入反應(yīng)混合液3 mL和上清液1 mL，另一支為對照（加入不加酶的反應(yīng)混合液）。利用分光光度計測量波長470 nm下的吸光值。用秒表每1 min讀取一次數(shù)值，酶活性的含量多少用每分鐘吸光值變化表示[14]。

式中，ΔA470為反應(yīng)時間內(nèi)吸光度的變化；Vt為粗酶液的總體積（mL）；W為生菜葉片鮮質(zhì)量（g）；VS為測定時取用的酶液體積（mL）；t表示反應(yīng)時間。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)，采用Microsoft Excel 2010繪圖并且對各個數(shù)據(jù)進行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度CuSO4溶液對生菜種子萌發(fā)的影響

由圖1可知，在同一發(fā)芽時間，隨著Cu2+濃度的升高，生菜種子萌發(fā)量呈先升高后降低的變化趨勢；與CK相比，5，10 mg/LCu2+脅迫對生菜種子萌發(fā)有促進作用，其中，10 mg/L Cu2+脅迫對生菜種子萌發(fā)的促進作用最明顯，而 20，50，80，120 mg/LCu2+脅迫對生菜種子萌發(fā)均有抑制作用，其中，120 mg/L Cu2+脅迫對生菜種子萌發(fā)狀況的影響極其顯著。由此可見，在低濃度Cu2+作用下，生菜種子的萌發(fā)較快，在較高濃度Cu2+作用下，生菜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均呈下降趨勢。

2.2 不同濃度CuSO4溶液對生菜幼苗形態(tài)的影響

株高和根長是觀察重金屬對植物影響的重要表觀特征。由圖2可知，生菜幼苗株高與CK相比，分別減少 9，12，15，17，18，22 mm；生菜幼苗根長與CK 相比，分別減少 32，35，38，45，46，47 mm；在5，10 mg/LCu2+脅迫下，幼苗株高和根長與CK相差不大，當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度≥20 mg/L時，生菜幼苗株高和根長與CK差異極其顯著，此時，生菜幼苗生長緩慢，從外形來看，胚軸呈卷曲狀，生長形態(tài)異常，并且幼苗根部停留在胚根階段，幾乎無法生長、伸長，根尖部顏色從淺黃色逐漸加深，最終變成深褐色。隨著Cu2+濃度的增大，生菜幼苗的可見葉片數(shù)逐漸減少，當(dāng)Cu2+濃度≥20 mg/L時，部分葉片出現(xiàn)褐色斑點。由此可見，隨著Cu2+濃度的增大，脅迫作用逐漸增強，且Cu2+脅迫對生菜幼苗根的毒害作用大于對幼苗的毒害作用。

2.3 不同濃度CuSO4溶液對生菜幼苗葉綠素含量的影響

從圖3可以看出，與CK相比，低質(zhì)量濃度的Cu2+（5～20 mg/L）促進生菜幼苗葉綠素的合成，高質(zhì)量濃度的Cu2+（50～120 mg/L）會抑制葉綠素的合成。對于葉綠素b來說，只在Cu2+質(zhì)量濃度為5 mg/L時含量稍有提高，其他濃度與空白相比無顯著變化；而葉綠素a和總含量，同樣在Cu2+質(zhì)量濃度為5 mg/L時含量最高，在Cu2+質(zhì)量濃度為50 mg/L時與空白相比差異顯著，抑制了葉綠素的合成。

2.4 不同濃度CuSO4溶液對生菜幼苗SOD，POD活性的影響

由圖4可知，當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度由0 mg/L升高到20 mg/L時，生菜幼苗中SOD活性逐漸升高；當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度達到50 mg/L時，SOD活性最高；隨后，生菜幼苗中SOD活性逐漸下降。當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度由0 mg/L升高到20 mg/L時，生菜幼苗中POD活性差異不明顯；當(dāng)Cu2+質(zhì)量濃度升高到50 mg/L時，POD活性最高；隨后隨著Cu2+濃度的升高，POD活性逐漸降低。

3 結(jié)論與討論

種子萌發(fā)、幼苗生長是植物對外界脅迫比較敏感的時期，探究在脅迫的條件下植物種子萌發(fā)和幼苗生長的狀況，從某方面來說，能反映出植物對脅迫的耐性和抗性，其可作為檢測土壤重金屬污染的指標(biāo)[15-16]。本試驗研究了不同濃度Cu2+對生菜種子萌發(fā)和幼苗生長的脅迫作用，證實了Cu2+對生菜種子萌發(fā)、幼苗生長具有顯著影響，對萌發(fā)狀況、株高、根長以及葉綠素、保護酶等生理生化指標(biāo)有一定的影響。

閆曉明等[17]研究表明，當(dāng)重金屬離子濃度較低時，會促進植物種子萌發(fā)，當(dāng)重金屬離子濃度較高時，會抑制植物種子萌發(fā)。銅是植物生長發(fā)育的必需微量元素之一，但是過多的銅會導(dǎo)致植物體代謝紊亂，從而影響植物的生長發(fā)育[18-19]。隨著Cu2+質(zhì)量濃度的升高，生菜種子萌發(fā)參數(shù)呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。其中，Cu2+質(zhì)量濃度為10 mg/L時，生菜種子的萌發(fā)狀況達到最大值，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，可參考該濃度來催芽。本研究表明，隨著Cu2+濃度的升高，生菜幼苗的葉綠素含量先升高后降低，這與王威等[20]、PENELOPE等[21]的研究結(jié)論相同。原因可能是由于過高濃度的Cu2+會破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，尤其是葉綠體結(jié)構(gòu)，阻礙了葉綠素的合成；另一方面，Cu2+會加速葉片中原有的葉綠素的氧化分解，導(dǎo)致葉綠素含量下降。

研究表明，在重金屬Cu作用下，使植物體內(nèi)產(chǎn)生大量活性氧，導(dǎo)致氧化脅迫，而在植物體內(nèi)，SOD是不可缺少的抗氧化酶，有清除活性氧、防止脂膜過氧化的作用[16]。植物可以通過自身的保護酶系統(tǒng)清除過多的活性氧，維持體內(nèi)活性氧代謝平衡[8]。本研究結(jié)果表明，SOD，POD活性隨著Cu2+濃度的升高均呈現(xiàn)先升高后略微降低的趨勢，這與程貫召[5]的研究結(jié)果基本相同。在逆境脅迫下，SOD是避免細(xì)胞受到活性氧傷害的第一道防線，SOD活性增強是植物對Cu2+脅迫的應(yīng)激反應(yīng)。但是在高濃度Cu2+脅迫下，SOD活性略微下降，說明植物吸收大量Cu2+后，對SOD的合成有所影響。POD活性的增加說明，在Cu2+脅迫下，植物體內(nèi)H2O2濃度增加，但隨后有所下降，可能與植物吸收大量Cu2+后，影響了POD的合成有關(guān)。

本試驗結(jié)果表明，低濃度的Cu2+對生菜種子萌發(fā)有一定的促進作用，高濃度的Cu2+抑制生菜種子的萌發(fā)；當(dāng)Cu2+濃度≥10 mg/L時，生菜種子萌發(fā)參數(shù)呈降低趨勢。因此，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)生活中，可參考該濃度來催芽；同時生菜種子的萌發(fā)狀況和幼苗長勢還可作為土壤重金屬污染程度的指標(biāo)。

本試驗選擇了容易培養(yǎng)的綠色葉類蔬菜生菜作為試驗材料，最終的結(jié)果能否代表所有蔬菜在不同濃度Cu2+脅迫下的生長狀況，還需進一步研究。本試驗只做了一次預(yù)試驗，3次平行試驗，受試驗環(huán)境設(shè)備條件以及自身能力等方面的制約以及其他外在因素和實驗誤差的影響，所以，最終的試驗結(jié)果能否代表不同濃度Cu2+脅迫下生菜種子萌發(fā)和幼苗生長的狀況，還需進一步探究。