氟樂靈對萱草多倍體的誘導(dǎo)

李永平，李 麗，梁 崢，賈民隆，曹冬梅

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，山西太原030031）

多倍體育種是培育植物新品種的一個重要途徑[1-6]。多倍體植物一般具有營養(yǎng)器官的巨大性[7]、植株抗性強、生長率高的優(yōu)點，而這些特點恰好都符合人們對觀賞植物的育種方向，因而多倍體育種在觀賞植物育種領(lǐng)域很受歡迎。

秋水仙素是一種常規(guī)的、應(yīng)用廣泛的多倍體育種誘變劑[8-10]，它對染色體結(jié)構(gòu)以及變異的影響很小[9]，同時能夠在細胞分裂中期阻礙紡錘絲形成，進而中斷有絲分裂的過程[4]。然而，秋水仙素對植物材料和試驗者的毒害作用是不容忽視的，尋找新型、廉價、低毒的的化學(xué)試劑或其他誘導(dǎo)方法替代秋水仙素是目前急需解決的問題。

大花萱草屬百合科萱草屬多年生宿根花卉，具有適應(yīng)性強、花大艷麗等優(yōu)點，具有很高的觀賞價值。目前，萱草育種以雜交手段為主，受季節(jié)限制一年只能進行一次，雜交后代的繁殖量也很難迅速提升。山西省農(nóng)科院園藝研究所觀賞植物課題組曾采用秋水仙素作為誘導(dǎo)劑，成功地獲得了四倍體萱草[11]。

本試驗在先前試驗的基礎(chǔ)上，以萱草愈傷組織和不定芽為試材，氟樂靈為誘變劑，通過浸泡法和混培法探索萱草多倍體的誘導(dǎo)條件，旨在為萱草多倍體育種提供更多的可能性。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試材料為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所觀賞植物研究室培育的萱草雜交品種10-154（Hemerocallis fulva 10-154）組培苗。該品種為二倍體（2X＝22）。

1.2 試驗方法

選擇生長健壯、帶有綠色芽點、組織緊密的愈傷組織，切取邊長0.5 cm左右的立方體小塊供試；選擇和分離生長健壯、長勢一致的不定芽供試。將2種材料分別用氟樂靈溶液處理，誘導(dǎo)方法包括浸泡和混培2種。

1.2.1 浸泡法 無菌條件下，將愈傷塊或不定芽浸入不同濃度（0，0.002%，0.006%，0.01%，0.03%）的氟樂靈溶液中，置于搖床上振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為80～100 r/min，分別于6，12，24 h時取出材料置于無菌操作臺上，用無菌蒸餾水沖洗4次，每次清洗5 min，待吸水紙吸干材料表面水分后置于分化培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)（分化培養(yǎng)基為MS＋6-BA0.1 mg/L＋KT 0.1mg/L＋NAA0.05mg/L＋蔗糖30g/L＋瓊脂5.3g/L，培養(yǎng)溫度為（25±2）℃，光照為5 000 lx，光照時間為 16 h/d）。

每組處理包括愈傷組織30塊，不定芽40個，重復(fù)3次。25 d后分別統(tǒng)計愈傷組織存活率及其上芽的生長系數(shù)、不定芽的存活率和增殖系數(shù)。將成活植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂5.3 g/L）中，20 d后統(tǒng)計誘變率。

1.2.2 混培法 將愈傷塊或不定芽材料分別接種至添加了不同濃度（0，0.001%，0.004%，0.007%，0.01%）氟樂靈的培養(yǎng)基上，3，5，7d后轉(zhuǎn)入不添加氟樂靈的正常分化培養(yǎng)基（MS＋6-BA0.1mg/L＋KT0.1mg/L＋NAA 0.05 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂5.3 g/L）中繼續(xù)培養(yǎng)（培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照 5 000 lx，光照時間16 h/d）。

每組處理包括愈傷組織30塊，不定芽40個，重復(fù)3次。25 d后分別統(tǒng)計愈傷組織的存活率及其上芽的生長系數(shù)、不定芽的存活率和增殖系數(shù)。將成活植株轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L＋蔗糖30 g/L＋瓊脂5.3 g/L）中，20 d后統(tǒng)計誘變率。

1.3 測定項目及方法

誘導(dǎo)所得材料的倍性鑒定采用染色體制片法[12]。切取再生植株的幼嫩根尖，放入對二氯苯飽和溶液中預(yù)處理5 h，蒸餾水清洗后在4℃的新鮮卡諾固定液處理22 h，然后進行水洗，并轉(zhuǎn)入70%乙醇中備用。壓片前取出備用根尖，于60℃，1 mol/L鹽酸中解離8 min，卡寶品紅染色15 min，常規(guī)壓片，Nikon顯微鏡觀察、計數(shù)并照相。每處理統(tǒng)計15個細胞，以具有一致的染色體數(shù)作為該植株的染色體數(shù)目。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，所有數(shù)據(jù)均經(jīng)鄧肯式新復(fù)極差測驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 浸泡法處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

浸泡法處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響結(jié)果表明（表1），不同濃度的氟樂靈浸泡處理后，愈傷組織隨氟樂靈濃度的增大和處理時間的延長，存活率逐漸降低；不定芽增殖系數(shù)也隨氟樂靈濃度增大和處理時間的延長而呈降低的趨勢。當氟樂錄濃度為0.002%時，愈傷組織的存活率在50.00%～94.44%，愈傷塊上不定芽的增殖系數(shù)受處理時間的影響不明顯，在1.86～2.10；當氟樂靈濃度為0.006%時，愈傷組織的存活率明顯降低至25.00%～66.67%，其上不定芽的增殖系數(shù)與0.002%處理組差異不大；當氟樂靈溶液濃度增大至0.01%～0.03%時，愈傷組織的存活率明顯下降，0.03%濃度處理24 h時，氟樂靈的毒害作用使存活率降至最低點（2.78%），同時愈傷組織分化不定芽的數(shù)量迅速減少，6 h時芽增殖系數(shù)僅為0.39，隨著時間的延長，出芽數(shù)量降至0。低濃度氟樂靈溶液的處理組合誘變率很低，0.002%濃度處理組誘導(dǎo)率均低于10%，隨著濃度的升高和處理時間的延長，誘變率逐漸提高，0.01%處理12 h的誘導(dǎo)率升至22.22%；但高濃度、長時間的處理組合又使愈傷組織的不定芽分化數(shù)減少，繼而導(dǎo)致誘變率處于低水平。最優(yōu)組合需要在獲得較高誘導(dǎo)率的同時保持較高的成活率，因此綜合考慮，浸泡法誘導(dǎo)愈傷組織染色體加倍試驗的最佳處理組合為：0.01%氟樂靈處理12 h，此時成活率為41.67%，誘變率為22.22%。

表1 氟樂靈浸泡處理對萱草愈傷組織誘導(dǎo)多倍體的影響

2.2 浸泡法處理對不定芽誘導(dǎo)的影響

用不同濃度氟樂靈溶液浸泡處理萱草不定芽的試驗結(jié)果表明（表2），不定芽存活率隨著氟樂靈濃度的增大和處理時間的延長逐漸降低。當氟樂靈的濃度為0.002%時，存活率為40.00%～66.67%，不定芽增殖系數(shù)為1.65～2.13；當氟樂靈濃度上升到0.006%時，不定芽的增殖系數(shù)為1.25～1.73，當處理時間為24 h時，存活率僅為20%；當氟樂靈濃度增至0.01%～0.03%時，氟樂靈的毒害作用顯著抑制不定芽的存活率，此時存活率降至0～33.33%。低濃度氟樂靈溶液的處理組合的誘導(dǎo)率很低，0.002%濃度時誘導(dǎo)率為1.11%～8.47%，隨著濃度的升高和處理時間的延長，多倍體誘導(dǎo)率明顯提高，在0.01%的濃度處理6 h后，誘導(dǎo)率達到21.75%；但高濃度、時間長的處理容易降低誘導(dǎo)率，當氟樂靈濃度0.03%處理24 h時，其誘導(dǎo)率為0。綜合考慮，氟樂靈浸泡誘導(dǎo)不定芽染色體加倍試驗以0.01%處理6 h組合效果較好，此時誘導(dǎo)率最高，為21.75%，成活率為26.67%。

表2 氟樂靈浸泡處理對萱草不定芽增殖的影響

2.3 混培法處理對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

混培法處理對萱草愈傷組織的誘導(dǎo)結(jié)果表明（表3），隨著氟樂靈濃度的增大和處理時間的延長，萱草愈傷組織的存活率逐漸降低。當氟樂靈的濃度為0.001%時，愈傷組織的存活率在60%～80%，其上不定芽的增殖系數(shù)為1.12～1.79。此時的存活率波動幅度及其上不定芽的增殖系數(shù)波動都不大，說明較低濃度的氟樂靈對萱草愈傷組織生長狀態(tài)的影響較??；當氟樂靈濃度為0.004%時，愈傷組織的存活率在50.00%～58.33%，其上不定芽的增殖系數(shù)在0.86～1.21；當氟樂靈濃度繼續(xù)上升到0.007%時，混培處理7 d的存活率迅速下降到30%，其上不定芽增殖系數(shù)也迅速減小至0.58；當氟樂靈濃度達到0.01%、混培處理7 d時，氟樂靈的毒害作用加劇，使愈傷組織的存活率降至最低26.67%，其上不定芽的增殖系數(shù)為0.60。結(jié)果顯示，低濃度氟樂靈的處理組合對萱草愈傷組織的誘變作用很小，0.001%濃度處理組的誘導(dǎo)率僅為0～7.65%；隨著濃度的升高和處理時間的延長，誘導(dǎo)率明顯提高，0.007%濃度處理5 d的誘導(dǎo)率可達35.74%，同時高濃度、長時間的氟樂靈處理會導(dǎo)致誘導(dǎo)率的降低，這可能是由愈傷組織存活率低、產(chǎn)生不定芽的數(shù)量少導(dǎo)致的。綜上所述，氟樂靈混培法誘導(dǎo)愈傷組織染色體加倍試驗的最優(yōu)組合為：0.007%處理5 d，此時愈傷組織成活率為50%，誘導(dǎo)率為35.74%。

表3 氟樂靈混培處理對萱草愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.4 混培法處理對不定芽誘導(dǎo)的影響

試驗結(jié)果表明（表4），隨著氟樂靈濃度的增大和處理時間的延長，萱草的不定芽存活率逐漸降低。當氟樂靈濃度為0.001%時，存活率從3 d的87.5%下降到7 d的65.0%，不定芽的增殖系數(shù)從2.10下降到0.95；當氟樂靈濃度在0.004%時，不定芽的存活率在60.0%～72.5%，其增殖系數(shù)也呈現(xiàn)大幅下降的趨勢；當氟樂靈濃度增大至0.007%時，不定芽的存活率為35.0%～67.5%；當氟樂靈濃度為0.01%時，不定芽存活率為35.8%～50.0%，不定芽的增殖系數(shù)為0.41～0.61。低濃度氟樂靈的誘導(dǎo)率很低，本試驗氟樂靈濃度為0.001%～0.004%的處理組合誘導(dǎo)率均低于10%；隨著濃度的升高和處理時間的延長，誘導(dǎo)率明顯提高，至氟樂靈濃度0.007%、處理時間7 d時，誘導(dǎo)率升高至13%。較高濃度較長時間的處理組合，存活率和誘導(dǎo)率均處于比較低的水平，氟樂靈濃度為0.01%時，不定芽誘導(dǎo)率為3.04%～5.31%。綜上所述，氟樂靈混培誘導(dǎo)愈傷組織染色體加倍的最佳處理濃度為0.007%，最佳處理時間為7 d，此條件下，不定芽成活率為35%，誘導(dǎo)率為13%。

表4 氟樂靈混培處理對萱草不定芽增殖的影響

3 結(jié)論與討論

氟樂靈作為一種多倍體誘變劑，由于其毒性弱、價格低廉、誘導(dǎo)效果好，已在多種園藝植物上得到廣泛應(yīng)用。本試驗中，若以愈傷組織作為外植體，萱草多倍體的誘導(dǎo)以氟樂靈濃度0.007%混培處理5 d的效果最好，成活率可達50%，誘導(dǎo)率達到35.74%；若以不定芽作為外植體，萱草多倍體的誘導(dǎo)以氟樂靈濃度0.01%浸泡處理6 h的誘變率最高，可達21.75%。前人的研究表明[13]，當氟樂靈的濃度為180 μmol/L時，對南瓜幼嫩小苗的誘導(dǎo)率最高，完全可以代替誘導(dǎo)劑秋水仙素來誘導(dǎo)植株加倍。這與山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所觀賞植物課題組前期用秋水仙素混培處理萱草愈傷組織相比較，誘導(dǎo)率差異不大，但存活率明顯提高，從誘導(dǎo)時間上來看，氟樂靈誘導(dǎo)多倍體所需時間明顯低于秋水仙素處理時間[11]，秋水仙素在多倍體誘導(dǎo)過程中易造成染色體缺失，形成嵌合體[14-15]。因此，結(jié)合誘導(dǎo)率與死亡率、試驗成本、對植物的傷害、周圍環(huán)境、人體健康多方面考慮，氟樂靈作為萱草多倍體誘導(dǎo)的有效試劑更為合適。

在本試驗中，采用浸泡法和混培法誘導(dǎo)萱草多倍體植株，不同的誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)率也不同。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，采用氟樂靈作為誘導(dǎo)劑，選用混培法對外植體的傷害小，誘導(dǎo)率高，此結(jié)果與前人的研究結(jié)果略有不同[16-17]，這可能是由于材料不同、誘導(dǎo)部位不同，其還有待于進一步試驗驗證。