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    Meso-四(對(duì)甲基苯基)卟啉及其鈷配合物的光學(xué)性能與生物應(yīng)用

    2018-12-10 06:48:58張萬宇張曉娟佟佳霖陳天賜田俊強(qiáng)王志明
    關(guān)鍵詞:吡啶極性乙腈

    張萬宇 張曉娟*, 佟佳霖 陳天賜 田俊強(qiáng) 胡 蓉 王志明*,

    (1沈陽工業(yè)大學(xué)石油化工學(xué)院,遼陽 111003)

    (2香港科技大學(xué)深圳研究院,深圳 518000)

    0 引 言

    卟啉類化合物是維持動(dòng)植物生理活性的中心,在氧的傳輸、儲(chǔ)存及活化,酶催化,光合作用及電子傳遞過程中發(fā)揮著重要的作用[1-4]。近年來,科研工作者們通過不斷地改變卟啉母體化合物卟吩環(huán)上取代基的種類及位置,設(shè)計(jì)出一系列具有特定功能的卟啉類衍生物。如今,卟啉類化合物已被廣泛用于光電化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、分析化學(xué)、催化等諸多領(lǐng)域[5-12]。

    圖 1 TMPP (a)及 TMPP-Co (b)的合成路線Fig.1 Synthesis route of TMPP (a)and TMPP-Co (b)

    人們不斷地設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜的卟啉類化合物,反而忽視了對(duì)結(jié)構(gòu)較為簡單的卟啉類化合物的研究。因此本文制備并純化了meso-四(對(duì)甲基苯基)卟啉(TMPP)及其鈷配合物TMPP-Co,并對(duì)它們的溶劑化效應(yīng)、不同水含量下的發(fā)光情況及單線態(tài)氧(ROS)產(chǎn)生能力進(jìn)行了細(xì)致的討論,根據(jù)吸收及發(fā)射光譜的變化過程提出了相應(yīng)的發(fā)光機(jī)理。由于卟啉類化合物作為光動(dòng)力療法的光敏劑,在光的激發(fā)下能夠產(chǎn)生殺滅腫瘤細(xì)胞的單線態(tài)氧,目前已成為生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[13-16]。因此本文也嘗試用MAL(馬來酸酐)修飾的PEG(聚乙烯醇)包覆TMPP并用TAT(一種具有細(xì)胞膜穿透作用的多肽)修飾,以制備TMPP-MAL-TAT納米粒子,并探究其在細(xì)胞染色領(lǐng)域的應(yīng)用。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 TMPP及TMPP-Co的制備

    采用優(yōu)化后的Alder法[17]合成TMPP。取250 mL四口燒瓶,加入120 mL丙酸作溶劑兼催化劑,加熱攪拌至回流后停止加熱,待溫度降至110℃時(shí)滴加新蒸吡咯與對(duì)甲基苯甲醛 (物質(zhì)的量之比為1∶1.1,以0.05 mol吡咯為基準(zhǔn)),滴加結(jié)束后迅速加入2 mL硝基苯,繼續(xù)加熱攪拌至回流并開始計(jì)時(shí),反應(yīng)40 min后蒸出90 mL丙酸,停止反應(yīng),將反應(yīng)液冷卻至室溫,再放入-25℃環(huán)境中靜置過夜產(chǎn)生結(jié)晶沉淀,經(jīng)抽濾、洗滌獲得濾餅,用硅膠柱層析法提純,流動(dòng)相為二氯甲烷/石油醚(1∶3,V/V),收集第一色帶(紫色),旋干溶劑后得2.09g紫色晶體,收率為25%。 UV-Vis(DCM,λ/nm):S:412,Q:516,551,591,648。1H NMR(CDCl3,300 MHz):δ-2.77(s,2H,N-H),2.70(s,12H,-CH3),7.54(d,J=4.6 Hz,8H,Ph),8.08(d,J=4.7 Hz,8H,Ph),8.85 (s,8H,Py)。 IR (KBr,cm-1):3 335,2 914,1 504,1 470,1 348,982,838。 HRMS:C48H38N4計(jì)算值670.309 6,實(shí)驗(yàn)值670.226 4。

    采用一鍋法合成TMPP-Co。取250 mL四口燒瓶,加入精制后的TMPP 2 g,按TMPP與金屬鹽物質(zhì)的量之比1∶7加入一定質(zhì)量的乙酸鈷,以120 mL DMF做溶劑兼催化劑,攪拌加熱至回流開始計(jì)時(shí),反應(yīng)4.5 h后蒸出90 mL溶劑,停止反應(yīng),后處理過程與TMPP的后處理過程相同,其中柱層析法提純的流動(dòng)相為二氯甲烷/石油醚(1∶2,V/V),收集第二色帶 (橘紅色),旋干溶劑后得1.9 g紫色晶體,收率92%。 UV-Vis(DCM,λ/nm):S:413,Q:483。1H NMR(CDCl3,300 MHz):δ2.69(s,12H,-CH3),7.80(d,J=4.6 Hz,8H,Ph),8.47(d,J=4.7 Hz,8H,Ph),8.52(s,8H,Py);IR(KBr,cm-1):2 915,1 505,1 454,1 349,998,845;HRMS:C48H36CoN4計(jì)算值727.227 2,實(shí)驗(yàn)值727.141 7。

    1.2 光學(xué)性能測(cè)試

    分別稱取10 mg的TMPP及TMPP-Co,稀釋到10 mL四氫呋喃(THF)中,配成一定濃度的母液,采用日本島津公司UV-2600型紫外分光光度計(jì)及PerkinElmer公司LS-55型熒光分光光度計(jì)進(jìn)行吸收和發(fā)射光譜的測(cè)定。測(cè)試溶劑化及含水體系下的發(fā)射光譜時(shí),激發(fā)波長為其在該體系下S帶的吸收波長,狹縫寬度均為15 nm。

    1.3 電化學(xué)測(cè)試

    采用上海辰華CHI760E電化學(xué)工作站進(jìn)行循環(huán)伏安測(cè)試。以精制的二氯甲烷為正方向掃描溶劑,無水DMF為負(fù)方向掃描溶劑,配制成濃度為0.1 mol·L-1的四丁基六氟磷酸銨電解質(zhì)溶液。工作電極為玻碳電極,參比電極為Ag/AgNO3電極,輔助電極為鉑電極,以二茂鐵做內(nèi)標(biāo)(4.8 eV)。測(cè)試時(shí)將少量化合物加入到電解槽中,加入3 mL電解液,連接電極,設(shè)置參數(shù)(掃速為0.1 V·s-1)進(jìn)行正負(fù)方向掃描測(cè)試。在測(cè)試負(fù)向時(shí)要通入少量的氮?dú)狻?/p>

    HOMO能級(jí)的計(jì)算方法:

    Eoxonset:氧化初始電位;EFc-/Fc+:正方向二茂鐵氧化還原峰值平均值。

    LUMO能級(jí)的計(jì)算方法:

    Eredonset:還原初始電位;E′Fc-/Fc+:負(fù)方向二茂鐵氧化還原峰值平均值。

    能級(jí)差的計(jì)算方法:

    1.4 活性氧測(cè)試

    以THF為溶劑將TMPP及TMPP-Co配成濃度為1 mmol·L-1的母液。在避光條件下用1 mol·L-1的氫氧化鈉水溶液水解掉ROS(二氯熒光素二乙酯)中的乙酯使其成為二氯熒光素,即將ROS探針激活。取2.900 mL去離子水于比色皿中,加入30μL母液,再向比色皿中加入70μL激活后的ROS熒光探針,并讓他們充分混合均勻。加入熒光探針時(shí)要保證周圍環(huán)境昏暗或在避光條件下進(jìn)行,并且在接下來的測(cè)試中也要使周圍環(huán)境達(dá)到同樣條件。調(diào)節(jié)光源強(qiáng)度使其達(dá)到4 mW·cm-2,并使光照均勻。測(cè)試時(shí)間范圍為1~10 min,每光照1 min進(jìn)行一次熒光測(cè)試,設(shè)置熒光光譜的λex=488 nm(激發(fā)波長)和λem=520 nm(觀測(cè)波長);狹縫寬度為2 nm;測(cè)試熒光光譜范圍為495~700 nm。

    1.5 細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)

    采用商業(yè)購買的Hela細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)及傳代,先進(jìn)行TMPP與TMPP-Co對(duì)細(xì)胞的直接染色:在培養(yǎng)皿中加入1 mL培養(yǎng)基,加入150μL(或80μL)充分混合的細(xì)胞培養(yǎng)基,混勻后置于培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞貼壁后即可用于染色。用DMSO將染料配成1 mmol·L-1的母液,取5μL母液于培養(yǎng)皿中混勻,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后移去培養(yǎng)基,用PBS溶液洗3次以確保染料不再殘余在溶液中,再加入1 mL培養(yǎng)基,將其置于熒光顯微鏡下拍照,選用與染料的最大吸收波長相近的激光波長,若熒光微弱則可將染料濃度提高或染色時(shí)間延長,若熒光較強(qiáng)則可適當(dāng)降低染料濃度或縮短染色時(shí)間,以此來確定最適濃度和染色時(shí)間。確定后則可用最適濃度和時(shí)間進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    再用MAL(馬來酸酐)修飾的PEG(聚乙烯醇)進(jìn)行包覆TMPP衍生物納米粒子的制備及其TAT修飾。制備TMPP-TAT-NPs納米粒子的步驟如下:稱取1.0 mg TMPP,溶于1mL氯仿溶液中,得到1 mg·mL-1TMPP溶液。稱取1 mg MAL(馬來酸酐修飾的PEG),溶于0.5 mL TMPP溶液,再加入4.5 mL純水,得到0.1 mg·mL-1MAL-TMPP混合溶液。將0.1 mg·mL-1MAL-TMPP混合溶液超聲 (時(shí)間5 min,強(qiáng)度20%)使得TMPP和MAL充分接觸。往溶液中通入氮?dú)饧s6 h,使氯仿溶液揮發(fā)干后,將TMPP水溶液過濾膜,得到TMPP-MAL水溶液約50μg·mL-1。取0.5 mL TMPP-MAL水溶液,加入2μL TAT,攪拌過夜后透析2 d,得到約50μg·mL-1TMPP-MALTAT水溶液。取100μL于1 mL培養(yǎng)基中,混勻后與Hela細(xì)胞共培養(yǎng)9 h。

    用PBS沖洗細(xì)胞2次后用共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行拍照,觀察其染色情況。

    圖2 MAL修飾的PEG包覆的TMPP衍生物納米粒子及TAT修飾過程Fig.2 MAL-modified PEG coated TMPPderivatives nanoparticles and TAT modification process

    2 結(jié)果與討論

    2.1 溶劑化效應(yīng)

    每次取2.5 mL不同極性的溶劑于比色皿中,再加入50μL母液攪勻進(jìn)行溶劑化效應(yīng)測(cè)試,結(jié)果如圖3所示。從整體上看TMPP與TMPP-Co的發(fā)射峰強(qiáng)度及峰位變化存在一定的差異,但也存在一定的共性,如在甲苯中都發(fā)生了紅移;在乙腈、乙醇及異丙醇中均發(fā)生藍(lán)移。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)與金屬離子配位后,發(fā)光強(qiáng)度顯著下降。

    通過圖3a發(fā)現(xiàn),TMPP在不同極性溶劑中的變化較為規(guī)律:在質(zhì)子型極性溶劑中的發(fā)光較強(qiáng);在非質(zhì)子非極性溶劑中的發(fā)光較弱。按照溶劑極性順序,理論上TMPP在乙腈中的發(fā)光應(yīng)較強(qiáng),但由于其極性較大,使TMPP的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生扭曲,造成電荷分布不均,電子躍遷能隙變寬,激發(fā)態(tài)電子多以無輻射躍遷的形式回落至基態(tài),因此表現(xiàn)為發(fā)射峰變寬、發(fā)射峰位藍(lán)移及發(fā)射強(qiáng)度下降。而乙醇及異丙醇存在分子間氫鍵的作用,它們能形成較大體系的鏈狀結(jié)構(gòu),從而實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)光中心的包裹纏繞,降低了TMPP因振轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)而損耗的能量,使發(fā)光增強(qiáng);同時(shí),這種鏈狀結(jié)構(gòu)具有較大極性,同樣會(huì)使躍遷能隙變寬,表現(xiàn)出發(fā)射峰變寬及發(fā)射峰位藍(lán)移。這也預(yù)示著可以通過在meso位苯環(huán)對(duì)位上鏈接較長結(jié)構(gòu)的烷基鏈實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)光核的包裹,抑制分子間相互作用,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)卟啉在水相條件下及薄膜條件下的應(yīng)用。

    通過圖3b可知,TMPP-Co在不同極性溶劑中的發(fā)射峰強(qiáng)度變化是不規(guī)律的。特別是將TMPP-Co母液滴入乙腈后,溶液顏色由淺棕色立即變?yōu)辄S綠色。圖4為50μL母液在乙腈-THF混合溶劑中(總體積10 mL,乙腈含量用體積分?jǐn)?shù)表示)的吸收及發(fā)射光譜。如圖4a所示,隨著乙腈含量的逐漸增加,S帶吸收峰由單峰逐漸變?yōu)殡p峰,Q帶吸收峰漸漸消失,這是由于TMPP-Co的中心金屬離子與乙腈分子中氮上的孤對(duì)電子發(fā)生軸向配位形成圖6中的TMPP-Co(CN)[18]。 而乙腈分子屬于 p-π 共軛結(jié)構(gòu),在發(fā)生軸向配位后,能使發(fā)光中心的電子云密度增加,因此從圖4b中可以發(fā)現(xiàn)發(fā)射峰強(qiáng)度隨乙腈含量的增加逐漸增強(qiáng)。

    圖3 TMPP及TMPP-Co在不同溶劑中的發(fā)射光譜Fig.3 Emission spectroscopy of TMPPand TMPP-Co in different solvents

    圖4 TMPP-Co在不同體積比的乙腈-THF溶劑中的吸收 (a)和發(fā)射 (b)光譜Fig.4 Absorption (a)and emission (b)spectra of TMPP-Co in acetonitrile-THF solvents with different volume ratios

    圖5 TMPP-Co溶液在不同體積比的乙腈-THF溶劑中的顏色變化Fig.5 Color change of TMPP-Co solution in acetonitrile-THF solvents with different volume ratios

    圖6 TMPP-Co在乙腈或吡啶中發(fā)生軸向配位的機(jī)理Fig.6 Mechanism of axial coordination of TMPP-Co in acetonitrile or pyridine

    圖7 TMPP-Co在不同體積比的吡啶-THF溶劑中的吸收 (a)和發(fā)射 (b)光譜Fig.7 Absorption (a)and emission (b)spectra of TMPP-Co in pyridine-THF solvents with different volume ratios

    由于TMPP-Co可以發(fā)生軸向配位,選用具有大π共軛結(jié)構(gòu)的吡啶與THF配成混合溶劑(總體積10 mL,吡啶含量用體積分?jǐn)?shù)表示)加入50μL母液測(cè)得吸收及發(fā)射光譜如圖7所示。由圖7a可見,TMPP-Co的S帶吸收峰由單峰變?yōu)殡p峰,這表明TMPP-Co與吡啶發(fā)生了軸向配位,形成了圖6中的TMPP-Co(Py)。其中1號(hào)吸收峰呈現(xiàn)先下降后上升再下降的趨勢(shì),吸收峰位先藍(lán)移后紅移;2號(hào)吸收峰則隨著吡啶含量的增加逐漸變?yōu)榧绶迩覐?qiáng)度變化不規(guī)律,這說明TMPP-Co(Py)中出現(xiàn)了分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的過程,但TMPP-Co母體與軸向配體之間的電荷轉(zhuǎn)移存在一個(gè)相互競(jìng)爭的關(guān)系:即吡啶含量在0~15%內(nèi)是先逐漸形成TMPP-Co(Py),并增大母體TMPP-Co的大π環(huán)發(fā)光中心電子云密度,這一過程也導(dǎo)致吡啶配體表現(xiàn)出缺電子特性,使TMPP-Co(Py)分子內(nèi)形成 TMPP-Co 電子供體(D)及 Py 電子受體(A);隨著吡啶含量的增加,溶劑極性也隨之增強(qiáng),電荷由發(fā)光中心逐漸轉(zhuǎn)移至軸向的Py配體上,這一過程從圖7b中1號(hào)發(fā)射峰和2號(hào)發(fā)射峰強(qiáng)度的變化也可以得到印證 (吡啶含量20%~80%時(shí),1號(hào)發(fā)射峰強(qiáng)度迅速增強(qiáng);2號(hào)發(fā)射峰強(qiáng)度迅速下降);當(dāng)吡啶的含量達(dá)到 90%以上,TMPP-Co(Py)分子內(nèi)電荷分布趨于穩(wěn)定,此時(shí)體系中充滿含有π鍵的吡啶分子,出現(xiàn)了分子間較強(qiáng)的π-π相互作用。由于斥力的存在避免了TMPP-Co(Py)的相互堆疊,并使TMPP-Co(Py)整體結(jié)構(gòu)更加平整,因此發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng),吸收峰和發(fā)射峰也相應(yīng)地發(fā)生紅移。

    圖8 TMPP-Co在不同體積比的吡啶-THF溶劑中的發(fā)光機(jī)理Fig.8 Luminescent mechanism of TMPP-Co in pyridine-THF solvent with different volume ratios

    基于TMPP-Co在含π體系中發(fā)光規(guī)律,其在甲苯中發(fā)光強(qiáng)度的變化也可以得到合理的解釋:在甲苯中因π-π互斥作用,避免了由于TMPP-Co相互堆疊而引發(fā)的熒光淬滅,同時(shí)使電子盡可能多的局域在發(fā)光核附近。而其在乙醇及異丙醇中的發(fā)光強(qiáng)度與TMPP中的不同,這是由于異丙醇與乙醇相比多了一個(gè)具有供電性的甲基,導(dǎo)致氫鍵作用減弱且極性降低,但異丙醇通過軸向配位增強(qiáng)TMPP-Co中心的電子云密度。

    2.2 含水體系下的發(fā)光性能

    圖9 TMPP(a)及TMPP-Co(b)在水-THF溶劑中隨水含量增加1號(hào)發(fā)射峰強(qiáng)度的變化Fig.9 Change of intensity of emission peak 1 of TMPP (a)and TMPP-Co (b)with increasing water content in water-THF solvents

    圖10 TMPP及TMPP-Co在不同體積比的水-THF溶劑中的吸收 (a,c)和發(fā)射 (b,d)光譜Fig.10 Absorption (a,c)and emission (b,d)spectra of TMPPand TMPP-Co in water-THF solvents with different volume ratios

    圖11 TMPP在不同體積比的水-THF溶劑中的發(fā)光機(jī)理Fig.11 Luminescence mechanism of TMPPin water-THF solvent with different volume ratios

    圖9 為TMPP與TMPP-Co的50μL母液在水-THF混合溶劑中(總體積10 mL,水的含量用體積分?jǐn)?shù)表示)1號(hào)發(fā)射峰的強(qiáng)度變化。從圖10中可知,TMPP與TMPP-Co的發(fā)射光譜強(qiáng)度隨著水含量的增加均呈現(xiàn)先上升后顯著下降的趨勢(shì),這說明二者均為ACQ型分子。對(duì)二者在不同水含量下的發(fā)光機(jī)理進(jìn)行了推測(cè):當(dāng)水含量較少時(shí),會(huì)受到水極性的影響,表現(xiàn)為極性增大,發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng);隨著水含量的增加,在水中氫鍵的作用下,溶劑自身形成鏈狀結(jié)構(gòu),實(shí)現(xiàn)對(duì)發(fā)光核的包裹纏繞,減少卟啉因自身振轉(zhuǎn)而損耗的能量,這與在乙醇及異丙醇中的發(fā)光機(jī)理相同,因此發(fā)光強(qiáng)度會(huì)有所增強(qiáng)[19];由于TMPP及TMPP-Co本身不溶于水,在水含量達(dá)到一定程度后,會(huì)發(fā)生聚集,體系逐漸變?yōu)樗托偷娜橐?,使TMPP及TMPP-Co分子發(fā)生扭曲。從圖10a及圖10c中的2號(hào)吸收峰也可以看到,S帶吸收峰均發(fā)生了明顯的紅移,并且吸收強(qiáng)度顯著下降,吸收峰變寬,出現(xiàn)較弱的肩峰。這些變化均表明它們是因結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致分子軌道重組,能隙變窄,發(fā)光中心的電荷發(fā)生轉(zhuǎn)移,因此出現(xiàn)熒光淬滅的現(xiàn)象。

    2.3 粘度對(duì)發(fā)光性能的影響

    圖12 TMPP及TMPP-Co在不同體積比的甘油-乙醇溶劑中的吸收 (a,c)及發(fā)射 (b,d)光譜Fig.12 Absorption (a,c)and emission (b,d)spectra of TMPPand TMPP-Co in glycerol-EtOH solvents with different volume ratios

    圖13 TMPP(a)及TMPP-Co(b)在甘油-乙醇溶劑中隨甘油含量增加1號(hào)發(fā)射峰強(qiáng)度的變化Fig.13 Change of the intensity of emission peak 1 of TMPP (a)and TMPP-Co (b)with increasing glycerol content in glycerol-EtOH solvents

    圖12 為TMPP及TMPP-Co的50μL母液在甘油-乙醇混合溶劑中的吸收和發(fā)射光譜 (總體積10 mL,甘油含量用體積分?jǐn)?shù)表示)。采用該方法進(jìn)一步探究這2種化合物在不同粘度下的發(fā)光機(jī)理。圖13為2種化合物1號(hào)發(fā)射峰隨甘油含量增加的變化規(guī)律,這與它們?cè)陔S水含量增加時(shí)發(fā)光強(qiáng)度的變化規(guī)律(圖9)基本一致。甘油含量較少時(shí),2種化合物均因粘度增大而使自身振轉(zhuǎn)受限,發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)。但觀察圖12a發(fā)現(xiàn),當(dāng)甘油含量達(dá)80%時(shí),S帶吸收峰出現(xiàn)了明顯的肩峰,并且吸收峰強(qiáng)度明顯下降,發(fā)生了一定程度的紅移,這說明粘度較大時(shí)TMPP的結(jié)構(gòu)確實(shí)發(fā)生了扭曲,并出現(xiàn)了電荷轉(zhuǎn)移的過程;然而觀察圖12b發(fā)現(xiàn)其發(fā)射峰位置未發(fā)生變化,也未出現(xiàn)新的發(fā)射峰,說明它仍然是以大π環(huán)為發(fā)光中心。TMPP-Co在高粘度下的發(fā)光機(jī)理與TMPP基本相同。該實(shí)驗(yàn)也證明了水相條件下發(fā)光機(jī)理的正確性。

    2.4 活性氧測(cè)試結(jié)果

    考慮到ROS探針在細(xì)胞生物體系內(nèi)的應(yīng)用日益成為光動(dòng)力學(xué)研究的熱點(diǎn),因此采用TMPP及TMPP-Co在水系條件下形成的納米粒子作為研究對(duì)象。圖14直觀地給出隨著時(shí)間的變化,ROS探針熒光強(qiáng)度的變化規(guī)律。其中,在TMPP體系中ROS的熒光強(qiáng)度隨著光照時(shí)間的增加逐漸增大,單線態(tài)氧的生成速度與光照呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。而在TMPP-Co的體系中,ROS的熒光強(qiáng)度起始時(shí)就相對(duì)較大,隨時(shí)間略有下降,說明其生成單線態(tài)氧的速度極快,能夠在1 min內(nèi)完成轉(zhuǎn)化,通過測(cè)試TMPP與TMPP-Co的電化學(xué)循環(huán)伏安曲線(圖15),發(fā)現(xiàn)其具有較低的氧化還原電位,并且能隙較低,很容易發(fā)生電子躍遷;此外,鈷離子的順磁性也能使TMPP-Co很容易發(fā)生電子從最低激發(fā)單重態(tài)至中心離子三重態(tài)的系間竄越[20];但從另外一個(gè)角度看,它的氧化過程可能不是以光控做為決速步驟。據(jù)此推測(cè)的單線態(tài)氧產(chǎn)生機(jī)理如圖16所示。鈷離子的引入確實(shí)在效果上增加了ROS的產(chǎn)生能力,從而起到活化氧化的作用,這對(duì)目前關(guān)注的工業(yè)仿生催化和細(xì)胞內(nèi)的診療都具有積極意義。

    圖14 TMPP及TMPP-Co的活性氧測(cè)試光譜圖Fig.14 Spectra of TMPPand TMPP-Co for active oxygen test

    圖15 TMPP及TMPP-Co循環(huán)伏安曲線對(duì)比Fig.15 Comparison of cyclic voltammograms of TMPPand TMPP-Co

    圖16 TMPP單線態(tài)氧產(chǎn)生的機(jī)理Fig.16 Singlet oxygen generation mechanism of TMPP

    2.5 細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)

    結(jié)合上面的數(shù)據(jù)分析,擬開展TMPP及TMPPCo在細(xì)胞層次的熒光成像應(yīng)用研究。從前文看TMPP及TMPP-Co具有良好的發(fā)光效率、電化學(xué)行為和產(chǎn)生活性氧的能力。本文用TMPP和TMPP-Co作為研究對(duì)象直接制備熒光探針??赡苡捎诜肿娱g較強(qiáng)的相互作用,導(dǎo)致這2種化合物很難采用傳統(tǒng)的DMSO溶解分散法制備熒光探針。盡管TMPP的溶解性較TMPP-Co有一定提高,但是發(fā)現(xiàn)其與Hela細(xì)胞作用10 h后均沒有觀測(cè)到細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)(圖17),與明場(chǎng)圖像對(duì)比,證明TMPP并未進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)部。這個(gè)原因可能是由于TMPP本身形成的粒子尺寸過大,很難通過細(xì)胞的吞噬效應(yīng)進(jìn)入細(xì)胞;而其在細(xì)胞機(jī)制培養(yǎng)液中也很難解離成單分子形式進(jìn)入細(xì)胞,從而導(dǎo)致其并未觀測(cè)到熒光信號(hào)。

    圖17 TMPP采用DMSO傳統(tǒng)法進(jìn)行細(xì)胞染色實(shí)驗(yàn)Fig.17 Cell staining experiment of TMPPusing DMSO traditional method

    因此,只能采用具有細(xì)胞膜穿透能力的TAT(TAT是一種具有細(xì)胞膜穿透作用的多肽)作為修飾,將納米粒子表面變?yōu)檎姾?,利用穿透機(jī)制進(jìn)入細(xì)胞。選擇TMPP進(jìn)行進(jìn)一步研究,將TMPP和馬來酸酐修飾的聚乙烯醇(MAL-PEG)包裹共混,使用氯仿作為主溶劑,然后利用氮?dú)獯蹈煞ㄖ苽浞€(wěn)定的納米粒子TMPP-MAL-NPs;進(jìn)一步采用原位點(diǎn)擊的反應(yīng),將富含氨基的TAT與納米粒子表面的馬來酰胺的雙鍵反應(yīng),得到TMPP-TAT-NPs,其納米粒徑為154 nm,ζ電位是9.9 mV。這個(gè)正的表面電位證明TAT已經(jīng)引入到納米粒子表面,而且正電荷有利于穿透細(xì)胞膜(細(xì)胞膜表面為負(fù)電位)。

    采用制備的TMPP-TAT-NPs對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)(圖18c),當(dāng)作用時(shí)間為2 h時(shí),納米粒子已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞并且局域在細(xì)胞內(nèi)溶酶體上,從暗場(chǎng)激發(fā)和重疊圖像中均可以觀測(cè)到顯著的熒光信號(hào)(這里仍使用綠色熒光作為偽色來提高對(duì)比度,實(shí)際熒光顏色為深紅色)。

    圖18 TMPP-TAT-NPs包覆的納米粒子及其對(duì)Hela細(xì)胞的熒光成像Fig.18 TMPP-TAT-NPs-coated nanoparticles and their fluorescence imaging on Hela cells

    3 結(jié) 論

    TMPP與鈷離子配位后,熒光強(qiáng)度下降。TMPP在不同極性溶劑中的發(fā)光會(huì)隨著溶劑極性的增強(qiáng)而增強(qiáng),但乙腈極性較大,會(huì)改變TMPP結(jié)構(gòu),使其發(fā)光強(qiáng)度減弱;而TMPP-Co在不同溶劑中的發(fā)光強(qiáng)度不僅與溶劑極性有關(guān),還與中心金屬離子的軸向配位有關(guān)。此外,TMPP-Co及TMPP在水含量增加的過程中,熒光強(qiáng)度呈先上升后下降的趨勢(shì),二者在含水量較大的體系中均形成水包油狀納米顆粒。當(dāng)水含量或粘度較大時(shí),這2種化合物的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生扭曲并且出現(xiàn)電荷轉(zhuǎn)移的過程,導(dǎo)致熒光淬滅。循環(huán)伏安測(cè)試顯示TMPP-Co具有較低的能級(jí)差,其在水相條件下產(chǎn)生活性氧的能力較強(qiáng)。采用TMPP制備的TMPP-TAT-NPs納米顆粒成功對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色,并具有一定的靶向性。

    致謝:感謝國家自然科學(xué)基金委面上項(xiàng)目(No.51673118)和深圳市基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(No.JCYJ20160428150429072)的資助;感謝胡蓉博士和王志明博士在生物成像實(shí)驗(yàn)及分析方面給予的幫助。

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