副豬嗜血桿菌高密度發(fā)酵工藝研究

耿笑林，張 翼，劉 鵬，張浩浩，翟路峰，李向東，黃玉欣，田克恭

（國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471003）

副豬嗜血桿菌病又稱多發(fā)性纖維素性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎，也稱格拉澤氏病，是由副豬嗜血桿菌引起的一種嚴(yán)重危害各年齡豬群的細(xì)菌性傳染?。?］。按照常規(guī)血清分型方法，可以將副豬嗜血桿菌分為 15 種血清型， 其中 1、5、10、12、13 型毒力最強(qiáng)，我國以血清4型和血清5型流行為主［2］。采用我國普遍流行血清型菌株（4、5型）研制的滅活疫苗是預(yù)防和控制該病的最有效方法［3］。目前，國內(nèi)副豬嗜血桿菌疫苗還是采用傳統(tǒng)的分離病原菌菌株，通過固體平板培養(yǎng)、滅活制備，該方法獲得的疫苗價格較為昂貴，產(chǎn)量低，成本高［4］，而采用液體發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)能很好地解決該問題［5］。由于副豬嗜血桿菌比較脆弱，對營養(yǎng)要求嚴(yán)格，在體外培養(yǎng)容易死亡，因此，其在體外培養(yǎng)時，培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分、培養(yǎng)時間和保存方式等是開展副豬嗜血桿菌相關(guān)試驗(yàn)的關(guān)鍵因素［6］。

高密度發(fā)酵可有效提高抗原產(chǎn)量和培養(yǎng)基的利用率，大幅度降低生產(chǎn)成本，顯著縮短生產(chǎn)周期，降低勞動強(qiáng)度，提高生產(chǎn)效率［7］，為副豬嗜血桿菌滅活疫苗的生產(chǎn)提供了一種新的有效可行的抗原制備工藝。該研究通過利用高密度發(fā)酵技術(shù)，培養(yǎng)副豬嗜血桿菌血清4型JS株和血清5型ZJ株，并制備二價滅活苗抗原，以期為國內(nèi)副豬嗜血桿菌流行菌株血清4型和5型二價滅活疫苗的規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑及設(shè)備：TSA培養(yǎng)基 （BD公司），TSB 培養(yǎng)基（BD 公司），BHI培養(yǎng)基（BD 公司），酵母提取物（OXOID），胰蛋白胨（OXOID），NaCl（天津凱通），葡萄糖（國藥試劑），輔酶Ⅰ（NAD，上海生工），維生素（上海生工），新生牛血清（浙江杭州四季青），204 消泡劑（Sigma），微量元素，HCl、NaOH。

IC222 EXCELLA恒溫培養(yǎng)箱購自德國Medcenter Einrichtungen公司，E24R恒溫培養(yǎng)振蕩器購自NBS公司，6132核酸蛋白測定儀購自德國Eppendort，10JS-7000C型發(fā)酵罐購自上海保興生物工程有限公司，1 000 L發(fā)酵設(shè)備購自上海迪沃信生物工程有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)菌株：副豬嗜血桿菌血清4型JS株和血清5型ZJ株凍干菌種由普萊柯生物工程股份有限公司國家獸用藥品工程技術(shù)研究中心分離、鑒定、保存［8］。

1.1.3 培養(yǎng)基及試劑配制：TSA固體培養(yǎng)基、TSB液體培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基，其他液體培養(yǎng)基及試劑按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法進(jìn)行制備。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 副豬嗜血桿菌生產(chǎn)用種子液的制備：取副豬嗜血桿菌血清4型JS株和血清5型ZJ株凍干菌種，分別用含0.05%的NAD和10%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基溶解，劃線接種于含0.05%的NAD和10%新生牛血清的TSA平板上，37℃培養(yǎng)24 h，挑選典型菌落，接種于含0.05%的NAD和10%新生牛血清的TSB培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)12 h，取樣經(jīng)純凈檢驗(yàn)合格后作為生產(chǎn)用種子。

1.2.2 不同培養(yǎng)基的篩選：對不同培養(yǎng)基TSB、BHI、LB在10 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，按4%的接種量進(jìn)行發(fā)酵罐接種，并添加10%血清和0.05%的NAD。設(shè)定攪拌速度為100～500 r/min，pH值通過添加HCl和NaOH控制在7.2～7.4，培養(yǎng)14 h。在培養(yǎng) 8、10、12、14 h 時取樣進(jìn)行活菌計數(shù)，測定不同培養(yǎng)基配方菌液中的活菌數(shù)和菌體密度（OD600nm值）。

1.2.3 TSB培養(yǎng)基的優(yōu)化：在TSB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上通過添加葡萄糖、大豆蛋白胨等對與副豬嗜血桿菌代謝相關(guān)的碳源、氮源進(jìn)行優(yōu)化。按4%的接種量進(jìn)行發(fā)酵罐接種，添加10%血清和0.05%的NAD。設(shè)定攪拌速度為100～500 r/min，pH值通過添加HCl和NaOH控制在7.2～7.4，37℃培養(yǎng)14 h。在培養(yǎng) 8、10、12、14 h 時取樣進(jìn)行活菌計數(shù)，測定不同培養(yǎng)基配方菌液中的活菌數(shù)和菌體密度（OD600nm值）。

1.2.4 血清添加量的優(yōu)化：對優(yōu)化TSB培養(yǎng)基的血清添加量按照2%、5%、8%、10%進(jìn)行調(diào)整，并通過批次添加和流加相結(jié)合的方式增加補(bǔ)料工藝，補(bǔ)料培養(yǎng)基成分為葡萄糖、血清、TSB、NAD、維生素、微量元素等。按4%的接種量進(jìn)行發(fā)酵罐接種，并添加0.05%的NAD。設(shè)定攪拌速度為100～500 r/min，pH值通過 HCl和 NaOH控制在 7.2～7.4，37℃培養(yǎng)14 h收獲，測定不同血清添加量情況下菌液中的活菌數(shù)和菌體密度（OD600nm值）。

1.2.5 副豬嗜血桿菌在1 000 L發(fā)酵罐中的培養(yǎng)：根據(jù)上述試驗(yàn)的測定結(jié)果，按照最優(yōu)發(fā)酵工藝進(jìn)行1 000 L發(fā)酵試驗(yàn)。按4%的接種量進(jìn)行發(fā)酵罐接種，并添加5%血清和0.05%的NAD。設(shè)定攪拌速度為 100～500 r/min，pH值通過添加 HCl和NaOH控制在7.2～7.4，37℃培養(yǎng)14 h收獲，測定不同血清添加量情況下菌液中的活菌數(shù)和菌體密度（OD600nm值）。連續(xù)3批次副豬嗜血桿菌血清4型 JS株發(fā)酵抗原編號為 K1809001、K1809002、K1809003，連續(xù)3批次副豬嗜血桿菌血清5型JS株發(fā)酵抗原編號為K1809004、K1809005、K1809006。

1.2.6 副豬嗜血桿菌二價滅活疫苗的制備：用自制水性佐劑按10%的比例與不同批次副豬嗜血桿菌血清4型JS株和5型ZJ株滅活抗原充分?jǐn)嚢杌靹颍?］，制成3批副豬嗜血桿菌二價滅活疫苗，具體見表1。3批疫苗中副豬嗜血桿菌血清4型JS株和5型ZJ株抗原含量均為2.0×109CFU/mL。

1.2.7 副豬嗜血桿菌二價滅活疫苗效力評價試驗(yàn)：將40只5～7周齡豚鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。第1～3組分別免疫3批副豬嗜血桿菌二價滅活疫苗，后腿肌肉注射，0.5 mL/只，另外設(shè)1個空白對照組。首免后21 d，按相同途徑、相同劑量進(jìn)行二免，二免后14 d采血。采用微量凝集方法檢測二免后14 d豚鼠血清中副豬嗜血桿菌血清4型和5型抗體效價。判定標(biāo)準(zhǔn)如下：免疫組10只豚鼠血清中副豬嗜血桿菌血清4型抗體幾何均值不低于1∶16，血清5型抗體幾何均值不低于1∶32判為合格，否則判為不合格。

表1 不同批號疫苗的抗原組成及佐劑含量

圖1 不同液體培養(yǎng)基中副豬嗜血桿菌生長情況檢測結(jié)果

1.2.8 檢測方法

1.2.8.1 菌體濃度測定：利用6132核酸蛋白測定儀在600 nm處測定其吸光度。

1.2.8.2 發(fā)酵液活菌計數(shù)：按《中華人民共和國獸藥典（2010年版）》進(jìn)行發(fā)酵液活菌計數(shù)，計算菌落形成單位（CFU）。

1.2.8.3 發(fā)酵液純粹檢驗(yàn)：培養(yǎng)結(jié)束后取樣，根據(jù)《中華人民共和國獸藥典（2010年版）》附錄對樣品進(jìn)行純粹檢驗(yàn)，結(jié)果應(yīng)為純粹。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同液體培養(yǎng)基對副豬嗜血桿菌生長情況的影響結(jié)果

培養(yǎng)結(jié)果表明，副豬嗜血桿菌在LB培養(yǎng)基中不生長，在TSB和BHI培養(yǎng)基中均可生長，差異不顯著（見圖1）?？紤]到BHI培養(yǎng)基的價格明顯高于TSB培養(yǎng)基，因此，選定TSB培養(yǎng)基作為后續(xù)優(yōu)化用基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

2.2 優(yōu)化TSB培養(yǎng)基對副豬嗜血桿菌生長情況的影響結(jié)果

通過對TSB培養(yǎng)基添加葡萄糖、大豆蛋白胨等進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，副豬嗜血桿菌在優(yōu)化后的TSB培養(yǎng)基中的生長情況顯著由于優(yōu)化前 （見圖2），因此，選定優(yōu)化TSB培養(yǎng)基作為后續(xù)發(fā)酵用培養(yǎng)基。

2.3 不同血清添加量對副豬嗜血桿菌生長情況的影響結(jié)果

圖2 TSB培養(yǎng)基優(yōu)化前后副豬嗜血桿菌生長情況檢測結(jié)果

血清在副豬嗜血桿菌抗原生產(chǎn)中占主要成本，優(yōu)化血清的添加量可以顯著降低副豬嗜血桿菌抗原生產(chǎn)成本。通過補(bǔ)料工藝優(yōu)化，結(jié)果表明，副豬嗜血桿菌在血清添加量為5%、8%、10%的情況下活菌數(shù)差異不顯著，當(dāng)血清的添加量降低至2%時活菌數(shù)顯著降低（見圖3），因此，選擇5%的血清添加量作為后續(xù)發(fā)酵添加量。

2.4 最優(yōu)培養(yǎng)條件下副豬嗜血桿菌連續(xù)3批次的1 000 L發(fā)酵結(jié)果

根據(jù)上述最優(yōu)的發(fā)酵工藝，對副豬嗜血桿菌進(jìn)行1 000 L生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果表明，血清4型JS株和血清5型ZJ株的活菌數(shù)和菌體密度OD600nm與10 L發(fā)酵罐結(jié)果差異不顯著 （見圖4），提示可進(jìn)行生產(chǎn)規(guī)模放大，用于二價滅活苗的抗原發(fā)酵。

2.5 副豬嗜血桿菌二價滅活疫苗效力評價試驗(yàn)結(jié)果

利用微量凝集方法檢測二免后14 d豚鼠血清中的副豬嗜血桿菌血清4型和5型抗體效價。由表2和表3可知，3批疫苗免疫組 （第1～3組）二免后14 d豚鼠血清中的副豬嗜血桿菌血清4型抗體幾何均值均大于1∶16，血清5型抗體幾何均值均大于1∶32，表明3批疫苗均判為合格。

3 討論

圖4 1 000 L規(guī)模發(fā)酵放大試驗(yàn)結(jié)果

表2 3批1 000 L發(fā)酵血清4型抗原所配疫苗效力檢驗(yàn)結(jié)果

表3 3批1 000 L發(fā)酵血清5型抗原所配疫苗效力檢驗(yàn)結(jié)果

高密度發(fā)酵在細(xì)菌培養(yǎng)及重組蛋白高效表達(dá)方面顯示出獨(dú)有的優(yōu)勢［10-11］。付強(qiáng)等［12］通過不同的培養(yǎng)方式對副豬嗜血桿菌進(jìn)行高密度發(fā)酵，使發(fā)酵液菌體抗原含量由最初的4.0×109CFU/mL提高到1.6×1010CFU/mL。該研究通過對不同培養(yǎng)基培養(yǎng)副豬嗜血桿菌過程進(jìn)行分析，尋找對代謝限制的核心營養(yǎng)源碳源和氮源，并通過代謝調(diào)控技術(shù)對關(guān)鍵營養(yǎng)單元物質(zhì)生長因子、微量元素和維生素的優(yōu)化實(shí)現(xiàn)最佳代謝流調(diào)控，在1 000 L發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化，副豬嗜血桿菌血清4型JS株和5型ZJ株的活菌數(shù)均達(dá)到2.5×1010CFU/mL。

副豬嗜血桿菌生長中需要動物血清中的生長因子、微量元素、維生素等，因此，血清濃度的高低與成本關(guān)系比較密切［6］。通過批次添加和流加相結(jié)合的方式增加補(bǔ)料工藝，在補(bǔ)料培養(yǎng)基中添加葡萄糖、血清、TSB、NAD、維生素、微量元素等，使關(guān)鍵成本血清的使用量降低了1/2，解決了業(yè)內(nèi)發(fā)酵成本普遍偏高的問題。最終成功地在1 000 L發(fā)酵規(guī)模上實(shí)現(xiàn)放大，完成了產(chǎn)業(yè)化。通過對3批次的1 000 L發(fā)酵規(guī)模抗原進(jìn)行疫苗制備，并利用替代動物豚鼠進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明所用抗原均合格。