平喘寧調(diào)節(jié)ERK信號(hào)通路干預(yù)哮喘氣道重塑的機(jī)制

方向明，劉 靜，嚴(yán)鄭元, 王心恒，屈 彬

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230012)

支氣管哮喘是由多種炎性細(xì)胞浸潤(rùn)后分泌的炎性遞質(zhì)和細(xì)胞因子作用于氣道的慢性炎癥。絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白酶的重要蛋白，是連接細(xì)胞外與細(xì)胞核之間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要通路，與細(xì)胞的增殖有著緊密聯(lián)系。其中，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)作為MAPKs家族中的一個(gè)亞族而存在，在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過(guò)程中起到重要調(diào)節(jié)作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，平喘寧治療哮喘的效果明顯，然而平喘寧的效應(yīng)與ERK信號(hào)通路的關(guān)系尚不明確，故設(shè)計(jì)此實(shí)驗(yàn)，旨在通過(guò)對(duì)ERK信號(hào)通路上作用因子進(jìn)行研究，進(jìn)一步揭示平喘寧治療哮喘的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥物 平喘寧(組成：麻黃、杏仁、半夏、陳皮、黃芪、太子參、浙貝母各9 g，蘇子、地龍、防風(fēng)各6 g，細(xì)辛3 g)：飲片來(lái)源于安徽中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂，平喘寧高、中、低劑量組的生藥含量分別為1.96、0.98、0.49 g/mL；地塞米松(批號(hào) 0300402)：上海信誼藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；桂龍咳喘寧膠囊(批號(hào) Z20053135)：山西桂龍醫(yī)藥有限公司。

1.2 試劑與儀器 卵蛋白(批號(hào) A8040)、SDS(批號(hào) 20130105487)：Sigma；Trizol(批號(hào) NR0002)、RIPA細(xì)胞裂解液(批號(hào) P0013B)：碧云天；甘氨酸[批號(hào) GB/T14156-93(I1352)]：Solarbio；TEMED(批號(hào) 20130105458)、Tris堿(批號(hào) 3255794)、過(guò)硫酸銨(批號(hào) 10111994)、丙烯酰胺(批號(hào) 10023150)：廣州偉伯科技有限公司；PVDF(批號(hào) 24937-79-9)：millipore；ECL超敏發(fā)光試劑盒(批號(hào) W001A)：南京善本生物科技有限公司；預(yù)染蛋白Marker(批號(hào) MK054)：合肥博美生物科技有限公司；p-ERK1抗體(編號(hào) bs4621)、ERK1抗體(編號(hào) bs1122)：Bioword；Actin(編號(hào) 131322)：北京中杉；山羊抗兔IgG(編號(hào) 107015)：上海合星生物科技有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組、模型復(fù)制及給藥 選用SPF級(jí)6～8周齡雄性SD大鼠140只，體質(zhì)量(250±20)g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(皖)2011-003]。將其隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型組，平喘寧高、中、低劑量組，桂龍咳喘寧組，地塞米松組。每組20只。

參照文獻(xiàn)[1-2]方法復(fù)制大鼠寒哮模型。除正常對(duì)照組外，其余6組在第1、8天，均腹腔注射10%卵蛋白1 mL以致敏；第15天開(kāi)始，超聲霧化1%卵蛋白溶液，連續(xù)7 d，以誘發(fā)哮喘，每次時(shí)間為30 min；然后將大鼠放入0～2 ℃可調(diào)節(jié)的寒冷箱中，每日1次，每次2 h。以大鼠出現(xiàn)精神萎靡，活動(dòng)度下降，反應(yīng)不靈敏，身體震顫、蜷縮，毛色晦暗，飲食量下降，大便稀，頻頻點(diǎn)頭，呼吸急促時(shí)伴有腹部收縮等現(xiàn)象，提示大鼠寒哮模型復(fù)制成功。正常對(duì)照組參照上述方法，在致敏及激發(fā)時(shí)采用9.0 g/L氯化鈉注射液替換卵蛋白溶液進(jìn)行注射。模型復(fù)制成功后，第21天開(kāi)始給藥，正常對(duì)照組、模型組以等容積9.0 g/L氯化鈉注射液進(jìn)行灌服；地塞米松組將地塞米松藥片碾碎后采用9.0 g/L氯化鈉注射液將其溶解，然后按照0.405 g/kg灌服；桂龍咳喘寧組按照10 g/kg灌服；平喘寧高、中、低劑量組分別按照19.6、9.8、4.9 g/kg灌服。灌胃4周，禁食24 h后，進(jìn)行哮喘激發(fā)試驗(yàn)。在2 h內(nèi)，用10%水合氯醛腹腔注射將大鼠麻醉，開(kāi)胸，取肺組織，分離左右肺，取左肺，用中性甲醛固定；將右肺置于凍存管內(nèi)，放在-80 ℃冰箱中凍存以備使用。

2.2 肺組織形態(tài)學(xué)觀察 將左肺置于中性甲醛中固定，脫水，石蠟包埋，切成3 mm組織薄片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，光鏡下觀察肺組織的病理變化。

2.3 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)TIMP-1、MMP-9表達(dá)水平 先用二甲苯脫蠟，再用乙醇梯度脫水，然后進(jìn)行抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶。模型組與各治療組滴加一抗溶液(1∶150)，正常對(duì)照組滴加PBS；將切片置于濕盒中，于4 ℃冰箱中過(guò)夜。第2天于常溫中復(fù)溫0.5～1 h，用PBS沖洗2遍，滴加二抗，20 min后再用PBS沖洗2遍，甩干，DAB顯色，封片，蘇木精復(fù)染，常規(guī)脫水，透明，干燥，中性樹(shù)膠封片。胞漿內(nèi)棕黃色顆粒提示MMP-9、TIMP-1表達(dá)陽(yáng)性。采用BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，于400倍顯微鏡下觀察切片，測(cè)其胞漿中積分光密度值，每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)算平均值。

2.4 Western blot法檢測(cè)PDGF、p-ERK1、ERK1蛋白表達(dá)水平 剪取100 mg肺組織，加入1 mL RIPA細(xì)胞裂解液將組織進(jìn)行裂解。置于離心機(jī)中，采用12 000 r/min離心10 min，收集上清液(含有組織總蛋白)。蛋白變性：蛋白樣品與2倍SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液等量混勻，沸水浴10 min。然后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、檢測(cè)等過(guò)程，最后采用Image J軟件分析灰度值。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠氣管組織形態(tài)學(xué)變化 光鏡下觀察，正常對(duì)照組大鼠的支氣管結(jié)構(gòu)未見(jiàn)改變，氣管上皮結(jié)構(gòu)正常，未見(jiàn)明顯炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組鏡下觀察到支氣管黏膜出現(xiàn)充血水腫，黏膜皺襞增多，黏膜下以及氣管周?chē)霈F(xiàn)大量炎性細(xì)胞，如嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，氣管上皮細(xì)胞出現(xiàn)脫落、剝離，支氣管管壁增厚，管壁平滑肌肌層以及基底膜增厚，氣管明顯變窄。與模型組比較，各治療組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，氣管上皮細(xì)胞脫落減少，氣管平滑肌增厚較治療前有不同程度的降低，氣管痙攣?zhàn)冋瓲顩r改善。其中地塞米松組大鼠炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少，氣管上皮脫落降低，氣管平滑肌增厚情況改善；桂龍咳喘寧組大鼠在炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、氣管上皮脫落及氣管平滑肌增厚等方面有不同程度改善，但效果不如地塞米松組明顯；平喘寧高劑量組大鼠氣管上皮完整，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度與地塞米松組相近。見(jiàn)圖1。

注:A.正常對(duì)照組;B.模型組;C.地塞米松組;D.桂龍咳喘寧組;E.平喘寧高劑量組;F.平喘寧中劑量組;G.平喘寧低劑量組圖1 各組大鼠氣管組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色,10×20倍)

3.2 各組大鼠肺組織MMP-9、TIMP-1表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組MMP-9和TIMP-1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各治療組MMP-9和TIMP-1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；其中地塞米松組和平喘寧高劑量組MMP-9和TIMP-1表達(dá)水平低于其他3個(gè)治療組。見(jiàn)表1和圖2、圖3。

3.3 各組大鼠肺組織PDGF、p-ERK1、ERK1蛋白表達(dá)水平比較 與正常對(duì)照組比較，模型組肺組織PDGF、p-ERK1和ERK1表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，各治療組肺組織PDGF、p-ERK1和ERK1表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)表2和圖4。

表1 各組大鼠肺組織中MMP-9、TIMP-1相對(duì)表達(dá)水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

注:A.正常對(duì)照組;B.模型組;C.地塞米松組;D.桂龍咳喘寧組;E.平喘寧高劑量組;F.平喘寧中劑量組;G.平喘寧低劑量組圖2 各組大鼠肺組織中MMP-9表達(dá)水平比較(免疫組織化學(xué)法,10×40倍)

注:A.正常對(duì)照組;B.模型組;C.地塞米松組;D.桂龍咳喘寧組;E.平喘寧高劑量組;F.平喘寧中劑量組;G.平喘寧低劑量組圖3 各組大鼠肺組織中TIMP-1表達(dá)水平比較(免疫組織化學(xué)法,10×40倍)

4 討論

氣道重塑是慢性哮喘反復(fù)發(fā)作的重要病理學(xué)改變。在促成纖維細(xì)胞增殖因子里，PDGF具有較強(qiáng)作用。并且PDGF又可通過(guò)活化的成纖維細(xì)胞的分泌，使靜態(tài)的成纖維細(xì)胞大量活化，反過(guò)來(lái)產(chǎn)生疊加效應(yīng)。而PDGF的活化信號(hào)是由Ras/raf/ERK級(jí)聯(lián)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的，Ras/raf/ERK信號(hào)通路是絲裂原活化蛋白激酶眾多途徑的重要構(gòu)成，而ERK1/2是該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的重要通路之一[3]。

p-ERK1是由ERK1/2磷酸化產(chǎn)生的，細(xì)胞核內(nèi)c-jun、NF-κB、c-fos等轉(zhuǎn)錄因子受到p-ERK1的影響，作用于磷酸化核轉(zhuǎn)錄因子和其他蛋白激酶等多種底物，對(duì)有關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生作用，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長(zhǎng)與發(fā)育等[4]。

在MMPs家族中，MMP-9和TIMP-1兩者在哮喘氣管壁細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)沉積和重構(gòu)中有著重要作用[5]。在正常生理情況下，MMP-9和TIMP-1維持在1∶1的相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，使ECM降解和沉積達(dá)到平衡。哮喘發(fā)作時(shí)，肺組織中MMP-9病理性升高，上皮下成纖維細(xì)胞異常增殖、活化，致使膠原纖維大量出現(xiàn)，導(dǎo)致氣道重構(gòu)；TIMP-1也出現(xiàn)異常升高的情況，進(jìn)一步加速ECM在氣管內(nèi)堆積，阻止組織恢復(fù)，促進(jìn)上皮纖維化，加重氣道重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展[6]。建立維持MMP-9和TIMP-1比例穩(wěn)定的方法，可為哮喘提供新的治療靶點(diǎn)[7]。

表2 各組大鼠肺組織PDGF、p-ERK1、ERK1相對(duì)表達(dá)水平比較

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

注：A.正常對(duì)照組；B.模型組；C.地塞米松組；D.桂龍咳喘寧組；E.平喘寧高劑量組；F.平喘寧中劑量組；G.平喘寧低劑量組

圖4 Western blot法檢測(cè)各組大鼠肺組織PDGF、p-ERK1、ERK1蛋白表達(dá)水平

平喘寧是臨床用于治療寒哮的經(jīng)驗(yàn)方，由射干麻黃湯與三子養(yǎng)親湯化裁而成，藥物由麻黃、蘇子、半夏、杏仁、地龍等中藥組成，功效溫肺化痰、止咳平喘，用于治療寒哮證。本研究結(jié)果提示，平喘寧治療寒哮的機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)ERK轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，降低PDGF、ERK1、p-ERK1的表達(dá)，調(diào)節(jié)MMP-9、TIMP-1的平衡，從而減輕氣道炎癥，抑制氣道重塑。