肝豆靈抑制Notch信號通路干預銅負荷致肝纖維化大鼠肝臟上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

吳 鵬，王亞東，方 穎，李茂濤，蔣懷周，鮑遠程

(1.安徽中醫(yī)藥大學，安徽 合肥 230012；2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

肝豆狀核變性(hepatolenticular degeneration，HLD)是一種銅代謝障礙性疾病，銅蓄積所致的肝細胞脂肪變性、活動性肝炎、肝纖維化是HLD患者的主要肝臟病理變化，肝纖維化在幾乎每個確診的患者肝臟均有發(fā)現(xiàn)[1-2]。中醫(yī)認為銅毒內(nèi)聚，濕熱、痰濁、瘀血相互蘊結(jié)是HLD肝纖維化的主要病機，臨床上以通腑利濕、化瘀散結(jié)中藥專方肝豆靈為主的綜合治療可有效促進HLD患者肝硬化及肝功能的恢復[3]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，肝豆靈可促進肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSC)凋亡，抑制肝細胞凋亡，從而發(fā)揮抗肝纖維化、減輕肝損傷的作用[4-5]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，在銅負荷大鼠纖維化肝組織，Notch信號通路配體Jagged1、受體Notch3被激活，下游Hes1蛋白與肌成纖維細胞標志物α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)表達區(qū)域大部分重合，并隨著肝纖維化的加重而同步表達增加，這說明銅沉積可通過Notch信號通路介導肝星狀細胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞(myofibroblast，MFB)并促其活化增殖[6]。

有研究表明，Notch信號通路參與調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)而在肝纖維化過程中發(fā)揮重要作用[7-8]。在HLD肝纖維化形成過程中，銅沉積可能通過Notch通路介導EMT而參與肝纖維化的形成，肝豆靈可能通過Notch信號通路，干預EMT環(huán)節(jié)而發(fā)揮抗肝纖維化作用。本研究旨在觀察肝豆靈對Notch信號通路關(guān)鍵信號分子的影響。

1 材料

1.1 動物 雄性SPF級SD大鼠40只，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2013-01]，12～13周齡，平均體質(zhì)量(200±20)g。

1.2 主要儀器 全自動生化儀(AU2700)：OLYMPUS；γ放射免疫計數(shù)器(FJ-2003)：華粵集團；石蠟切片機(RM2135)、圖像采集系統(tǒng)(Q550CW)：Leica；熒光定量PCR儀(ABI 7500)；化學發(fā)光檢測系統(tǒng)(3400)：Clinx科學儀器有限公司。

1.3 藥物及主要試劑 肝豆靈片：安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室，院藥制字Z20050071)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)、透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)試劑盒：建成生物工程研究所，貨號依次為C009-3、C010-3、A059-2、A030-1、H141；Masson試劑盒(G1340)：索萊寶科技有限公司；RT-PCR試劑(貨號12574030)：Thermo Fish公司；β-actin(貨號SC47778)：Santa Cruz公司；Hes1一抗(貨號ab71559)、α-SMA一抗(貨號ab32575)：Abcam公司；E-cadherin一抗(貨號14472)：CST公司；山羊抗小鼠二抗(貨號sc2005)：Santa公司；山羊抗兔二抗(貨號CW0103)：康為世紀生物科技有限公司；即用型SABC試劑盒(貨號SA1022)、DAB顯色試劑盒(貨號AR1025)：博士德公司。

2 方法

2.1 分組及模型復制 隨機將40只SD大鼠分為正常組，模型組，肝豆靈小劑量、中劑量、大劑量組，每組8只。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，模型組和肝豆靈組喂飼含硫酸銅1.5 g/kg的粉狀飼料和0.185%硫酸銅去離子水，共24周，以復制銅負荷大鼠模型[6]。從第12周開始，肝豆靈小劑量組大鼠每日給予0.243 g/kg(相當于成人劑量的3.15倍，為人體藥物等效折算劑量的1/2)肝豆靈片溶液(碾碎后溶于2 mL生理鹽水配制成混懸液)灌胃，肝豆靈中劑量組、大劑量組大鼠每日分別給予肝豆靈片0.486、0.729 g/kg肝豆靈溶液灌胃，正常組及模型組大鼠給予等容積生理鹽水灌胃，共12周。實驗過程中，模型組、肝豆靈中劑量組和大劑量組各有2只大鼠死亡，剩下34只大鼠在第24周實驗結(jié)束后，禁食12 h，10%水合氯醛4.0 mL/kg腹腔注射麻醉，心臟采血，3 000 r/min離心10 min，取血清；取部分肝組織，用4%中性甲醛固定，行病理及免疫組織化學法檢測；取部分肝組織，迅速采用液氮凍存后，于-80 ℃冰箱保存。

2.2 指標測定

2.2.1 血清生化指標及肝組織Hyp含量測定 采用全自動生化分析儀檢測血清ALT、AST、ALP含量；采用放射免疫法檢測血清HA含量；采用比色法檢測肝組織Hyp含量。

2.2.2 肝臟組織形態(tài)學檢查 采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)及Masson染色觀察肝組織病理損傷及膠原沉積狀況。在10×20倍光學顯微鏡下隨機選取5個視野，觀察并測量膠原纖維含量(膠原纖維面積/肝組織面積×100%，取平均值)。

2.2.3 實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor beta 1，TGF-β1)、Jagged1、Notch1、Notch3、Snail mRNA表達水平 由上海生工生物工程有限公司設(shè)計并合成引物(見表1)，依據(jù)以下步驟測定各基因mRNA的表達水平。①RNA提?。毫呀饨M織，按5∶1的標準加入氯仿，離心后上清液加入等容積異丙醇，加入1 mL 75%乙醇，棄上清，加入20 μL DEPC水保存。②cDNA合成：反應(yīng)體系為RNA 8.0 μL、Oligo(dT)1.0 μL、Buffer 4.0 μL、dNTP 2.0 μL、RNasin 1.0 μL、M-MLV 1.0 μL，PCR儀器上42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，取出反應(yīng)液即為cDNA；③實時PCR：反應(yīng)體系為2×SYBR Green Real-time PCR mixture 10 μL，10 μmol正向引物及反向引物各0.4 μL，2×ROX Ⅱ 0.4 μL，cDNA 2.0 μL，雙蒸水6.8 μL，95 ℃ 30 s預變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s擴增40個循環(huán)后，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。用2-ΔΔC(t)法計算待測基因mRNA的相對表達水平。

表1 實時熒光定量PCR引物

2.2.4 Western Blot法檢測Hes1、E-cadherin表達水平 將肝組織加入蛋白裂解液(1.0 mL RIPA 50 mg)后，取上清，采用BCA法對蛋白進行定量檢測后，配制10% SDS-PAGE凝膠后，加入蛋白樣品30 μg，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加一抗(β-actin 1∶1 000，Hes1 1∶400，E-cadherin 1∶400)后室溫孵育3 h，TBST洗脫3次，加入相應(yīng)的二抗(山羊抗小鼠1∶10 000，山羊抗兔1∶5 000)，室溫孵育1 h，采用ECL發(fā)光試劑盒檢測目的蛋白。采用Quantity one軟件分析灰度值。

2.2.5 免疫組織化學染色法檢測α-SMA 采用鏈霉親合素生物素過氧化物酶復合物(strept avidin-biotin complex,SABC)法檢測α-SMA，經(jīng)脫蠟、修復后，封閉液孵育25 min，滴加一抗(α-SMA 1∶200稀釋)，PBS沖洗后滴加生物素標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶100)及試劑SABC，DAB顯色。IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)測量平均光密度(mean optical density，MOD)，即積分吸光度與目標區(qū)域面積比值，用以代表陽性部位蛋白表達水平。

3 結(jié)果

3.1 各組血清ALT、AST、ALP、HA及肝組織Hyp水平比較 模型組大鼠血清ALT、AST、ALP、HA水平及肝組織Hyp和膠原纖維含量較正常組明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，肝豆靈各劑量組ALT、AST水平顯著降低(P<0.05)，肝豆靈中、高劑量組大鼠血清ALP、HA水平及肝組織Hyp和膠原纖維含量明顯降低(P<0.05)。見表1。各組肝組織膠原纖維沉積情況見圖1。

表1 各組大鼠血清ALT、AST、ALP、HA水平及肝組織Hyp和膠原纖維含量比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.2 肝臟組織形態(tài)學觀察 HE及Masson染色結(jié)果顯示，正常組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞排列整齊，未見脂肪變性、炎性反應(yīng)及纖維條索；模型組、肝豆靈小劑量組均可見粗大纖維條索，多個假小葉形成，肝細胞大片溶解壞死，合并脂肪變性，散在炎性細胞浸潤；肝豆靈中劑量組與模型組比較，假小葉由于肝細胞增殖而變大，纖維條索變細，肝細胞壞死減少，可見氣球樣變性、脂肪變性；肝豆靈大劑量組纖維化改善明顯，壞死、脂肪變性程度減輕，未見假小葉。見圖1、圖2。

注:A.正常組;B.模型組;C.肝豆靈低劑量組;D.肝豆靈中劑量組;E. 肝豆靈高劑量組

圖1各組大鼠肝臟組織形態(tài)學變化(HE染色，10×20倍)

注:A.正常組;B.模型組;C.肝豆靈低劑量組;D.肝豆靈中劑量組;E. 肝豆靈高劑量組

圖2各組大鼠肝臟組織形態(tài)學變化(Masson染色，10×20倍)

3.3 各組大鼠肝組織TGF-β1、Jagged1、Notch1、Notch3、Snail mRNA表達水平比較 與正常組比較，模型組TGF-β1、Jagged1、Notch1、Notch3、Snail mRNA表達水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，肝豆靈小劑量組Notch3 mRNA表達降低(P<0.05)，中劑量組、大劑量組所有指標均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

3.4 各組大鼠肝組織E-cadherin和Hes1表達水平比較 與正常組比較，模型組大鼠E-cadherin蛋白表達水平顯著降低，Hes1蛋白表達水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組比較，肝豆靈中劑量組、大劑量組E-cadherin蛋白表達水平顯著升高，Hes1蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

表2 各組大鼠肝組織TGF-β1、Jagged1、Notch1、Notch3、Snail mRNA表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

注：A.正常組；B.模型組；C.肝豆靈低劑量組；D.肝豆靈中劑量組；E. 肝豆靈高劑量組；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

圖3各組大鼠肝組織E-cadherin和Hes1表達水平比較(Western blot法，n=6)

3.5 各組大鼠肝組織α-SMA表達水平比較 免疫組織化學染色顯示，正常組大鼠肝組織α-SMA無明顯陽性表達；模型組及肝豆靈各治療組均可見α-SMA陽性細胞，胞漿呈棕黃或棕褐色，主要表達于靠近纖維條索的梭形肌成纖維細胞，在纖維增生的匯管區(qū)、血管旁及靠近纖維條索的肝竇周圍細胞亦有表達。蛋白平均吸光度檢測結(jié)果顯示，與模型組比較，肝豆靈中、大劑量組α-SMA表達水平顯著減少(P<0.05)。見表3和圖4。

4 討論

HLD作為銅代謝障礙性疾病，肝臟是銅中毒的原發(fā)靶器官和主要蓄積部位，過量銅在肝細胞聚集可產(chǎn)生大量氧自由基，誘導生物膜脂質(zhì)過氧化，引起蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的損害，導致肝細胞壞死、再生，肝星狀細胞增殖活化為肌成纖維細胞，后者分泌大量細胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)，形成肝纖維化[3-4]。有研究證實，在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程中，肝源細胞，包括肝細胞、肝星狀細胞、膽管上皮細胞、肝竇內(nèi)皮細胞等也能通過發(fā)生EMT而轉(zhuǎn)變?yōu)榧〕衫w維細胞[9-10]，抑制EMT可使肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)化生成減少，表現(xiàn)為特異性標志物α-SMA和Ⅰ型膠原蛋白的含量降低，從而阻止肝纖維化的發(fā)展，因此針對EMT的干預成為逆轉(zhuǎn)纖維化疾病的一種可行的方式[8，11-12]。

表3 各組大鼠肝組織α-SMA表達水平比較

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

A.正常組;B.模型組;C.肝豆靈低劑量組;D.肝豆靈中劑量組;E. 肝豆靈高劑量組;箭頭示肌成纖維細胞

圖4各組大鼠肝臟α-SMA表達水平(免疫組織化學染色，10×20倍)

Notch信號通路高度保守，通過介導生物細胞間信息交流而決定細胞的增殖、凋亡與分化，在纖維化EMT過程中有著重要的作用。Notch作為跨膜蛋白激活后，其活化形式胞內(nèi)區(qū)Notch(Notch intracellular domain，NICD)可作用于EMT關(guān)鍵因子Snail的啟動子，進而下調(diào)間質(zhì)標志物E-cadherin的合成，啟動EMT環(huán)節(jié)[9]。Notch通路中Jagged1、Notch1等是致纖維化重要誘導因子TGF-β1的效應(yīng)靶點，TGF-β1通過上調(diào)Jagged1、Notch1及下游Hes1的表達促進EMT環(huán)節(jié)參與組織纖維化。特異性沉默Jagged1基因可抑制TGF-β1誘導的上皮細胞EMT轉(zhuǎn)化。阻斷Notch信號通路可抑制上皮細胞Snail及α-SMA的表達，促進E-cadherin的合成，從而抑制上皮細胞發(fā)生EMT而轉(zhuǎn)型為肌成纖維細胞[11，13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，在銅負荷大鼠肝纖維化組織，Notch信號通路Jagged1/Notch1、Notch3/Hes1及α-SMA表達增加，EMT的核內(nèi)目的基因Snail升高，E-cadherin表達下降，說明銅沉積可以通過Notch通路介導EMT，誘導肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化生成及活化增殖而參與HLD肝纖維化的形成。

現(xiàn)代醫(yī)學已證實，HLD為常染色體隱性遺傳病，患者肝組織普遍存在不同程度的慢性活動性肝炎，且較早出現(xiàn)中晚期的肝纖維化表現(xiàn)[2]。中醫(yī)學認為，HLD肝纖維化根本原因是先天稟賦不足，腎的開合失司引起銅毒內(nèi)聚、濕熱內(nèi)蘊，從而阻礙氣機，導致瘀血與痰濁互結(jié)于脅下，形成“積聚”；膽汁外溢于肌膚、眼輪而表現(xiàn)身目發(fā)黃。毒邪日久不去，損傷絡(luò)脈，癥積不愈，加之脈絡(luò)壅塞，水濕不化而成“鼓脹”。因此銅毒內(nèi)蘊、痰瘀阻絡(luò)是HLD肝纖維化的主要病機[3]。

針對以上病機研發(fā)的通腑化瘀專方肝豆靈已在臨床應(yīng)用30余年，臨床療效確切。方中黃連、大黃、金錢草清熱燥濕、瀉熱通腑、利水通淋，共奏解毒通腑化濁之功。丹參、姜黃、莪術(shù)活血祛瘀、行氣破瘀、破血祛瘀，三藥協(xié)同增強活血化瘀散結(jié)之力。臨床研究證實，聯(lián)合肝豆靈進行中西醫(yī)結(jié)合驅(qū)銅治療可有效促進HLD患者肝纖維化指標、肝功能的恢復，作用優(yōu)于單純西藥治療[3]。實驗研究發(fā)現(xiàn)，肝豆靈具有誘導肝星狀細胞凋亡，干預p38MAPK信號通路蛋白的表達而發(fā)揮抗纖維化作用；能抑制肝細胞凋亡，上調(diào)肝組織miRNA-122的表達而修復肝損傷[15]。應(yīng)用代謝組學技術(shù)亦發(fā)現(xiàn)，肝豆靈對銅負荷大鼠小分子代謝物有明顯的調(diào)節(jié)效應(yīng)，從代謝網(wǎng)絡(luò)的多節(jié)點對HLD肝纖維化有干預作用[16-17]。

實驗發(fā)現(xiàn)，隨著肝豆靈劑量增加，銅負荷大鼠肝功能及肝纖維化血清學指標降低，肝組織壞死、脂肪變性程度減輕，膠原纖維含量減少，TGF-β1及Notch信號通路Jagged1/Notch1、Notch3/Hes1及α-SMA表達減少，EMT指標Snail降低，E-cadherin表達升高。因此推斷肝豆靈通過下調(diào)TGF-β1及Jagged1/Notch1、Notch3/Hes1信號通路而發(fā)揮抗銅負荷大鼠肝纖維化的作用，機制可能是抑制EMT環(huán)節(jié)而減少肌成纖維細胞的轉(zhuǎn)型生成及活化增殖。當然多組分的復方肝豆靈作用于哪些肝源細胞從而調(diào)控EMT環(huán)節(jié)？具體機制如何？尚需深入研究。