十味芪黃益腎方對(duì)慢性腎衰竭大鼠腎纖維化的干預(yù)作用

呂 勇，張艷楠，金 華，王 東，曹恩澤

(安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科，安徽 合肥 230031)

慢性腎衰竭(chronic renal failure，CRF)是慢性腎臟病(chronic kidney disease，CKD)進(jìn)行性進(jìn)展的共同結(jié)局，腎臟纖維化是其基本病理特征，探究CRF發(fā)病機(jī)制及延緩其病程進(jìn)展是目前研究的熱點(diǎn)。中醫(yī)藥在保護(hù)CRF患者殘存腎功能，改善腎纖維化等方面具有確切療效。依據(jù)曹恩澤辨治CRF的臨床驗(yàn)案，結(jié)合現(xiàn)代電腦數(shù)據(jù)挖掘分析而總結(jié)出的辨治CRF的核心組方—— 十味芪黃益腎方[1]，臨床研究結(jié)果已顯示其具有良好的療效[2]。本實(shí)驗(yàn)通過腺嘌呤灌胃[3]建立腎纖維化CRF大鼠模型，觀察該方對(duì)腎組織中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)、纖維連接蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)的影響，探究其抗腎纖維化的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 普通級(jí)SD雄性大鼠60只，均購自安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(皖)2011-002]，體質(zhì)量190～200 g，在安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 藥物與試劑 十味芪黃益腎方由生黃芪、槐米、煅龍骨、煅牡蠣各30 g，土茯苓15 g，生大黃、蒼術(shù)、地龍、僵蠶各10 g，全蝎2 g組成，購于安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院草藥房，配制成2.4 g/mL水溶液。纈沙坦膠囊(國藥準(zhǔn)字H20040217，規(guī)格為每粒80 mg)：由北京諾華制藥公司生產(chǎn)，配制成0.002 g/mL的混懸液。腺嘌呤(批號(hào)A8626)：由安徽欣樂生物技術(shù)有限公司提供。免疫組化法試劑TGF-β1(批號(hào)AD112007)、HGF(批號(hào)150420)和FN抗體(批號(hào)AE011910)：均購自北京博奧森生物科技有限公司。α-SMA抗體(批號(hào)GR212262-3)：購自上海源葉生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 動(dòng)物模型復(fù)制及分組 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將60只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表[4]分為正常組15只，另45只用于復(fù)制模型(模型復(fù)制組)，采用腺嘌呤灌胃[3]復(fù)制腎纖維化大鼠模型。操作步驟：第1～14天，按每千克體質(zhì)量給予濃度為2.5%腺嘌呤混懸液200 mg灌胃，每日1次；第14～28天，按每千克體質(zhì)量給予濃度為2.5%腺嘌呤混懸液200 mg灌胃，隔日1次。腺嘌呤灌胃累計(jì)總劑量每只不超過1.5 g。正常組用等量蒸餾水灌胃。大鼠在模型復(fù)制后第28天晚禁食12 h，第29天在大鼠目內(nèi)眥采血2 mL，測(cè)血清肌酐(serum creatinine，SCr)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)。模型組大鼠的SCr、BUN顯著高于正常組，提示腎纖維化模型復(fù)制成功。模型復(fù)制過程中死亡2只大鼠，剩余43只大鼠被隨機(jī)分為模型組13只、纈沙垣組15只和益腎方組15只

2.2 給藥方法 模型復(fù)制后次日開始給各組大鼠灌胃，每日1次。益腎方組將十味芪黃益腎方中藥水煎劑濃縮成每毫升含藥量為2.4 g的混懸液，按每千克體質(zhì)量10 mL的劑量灌胃；纈沙坦組將纈沙坦膠囊溶于溫水中制成每毫升含藥量為0.002 g的混懸液，按每千克體質(zhì)量10 mL的劑量灌胃；正常組和模型組給予等量蒸餾水，按每千克體質(zhì)量10 mL的劑量灌胃。療程均為8周。

2.3 觀察指標(biāo) 研究期間每日各組大鼠稱質(zhì)量，記錄并觀察大鼠精神狀態(tài)、活動(dòng)情況、毛發(fā)光澤度、進(jìn)食飲水量和二便情況。模型復(fù)制28 d后，各組大鼠目內(nèi)眥采血2 mL，檢測(cè)BUN、SCr，同時(shí)測(cè)定24 h尿蛋白(24-hour urinary protein，24hUPro)。各組大鼠于給藥治療8周后處死，處死前1天檢測(cè)24hUPro；腹主動(dòng)脈取血，采用生化法檢測(cè)BUN、SCr；采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)腎臟組織中TGF-β1、HGF、α-SMA、FN蛋白表達(dá)情況，采用ImagePro Plus多媒體彩色病理圖像分析軟件進(jìn)行分析，檢測(cè)染色部位蛋白陽性表達(dá)的平均光密度(mean optical density,MOD)；采用蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色及Masson染色觀察腎臟的組織形態(tài)學(xué)變化。

3 結(jié)果

3.1 一般情況比較 模型組大鼠于5～7 d后逐漸出現(xiàn)個(gè)體蜷臥，活動(dòng)減少，皮毛欠光澤，食欲下降，尿量增加，尾巴濕冷，耳廓顏色變淡；14 d后出現(xiàn)成群蜷臥、瞇眼、眼瞼浮腫、目內(nèi)眥顏色發(fā)白、皮毛干澀、脫毛、體質(zhì)量減輕等現(xiàn)象。正常組大鼠狀態(tài)無明顯變化。經(jīng)給藥8周后，益腎方組和纈沙坦組大鼠上述狀態(tài)改善，表現(xiàn)為食量及體質(zhì)量較給藥前增加，皮毛潤澤度改善，活動(dòng)度增加，目內(nèi)眥及耳廓較給藥前紅潤。益腎方組情況改善較纈沙坦組明顯。而模型組上述表現(xiàn)明顯加重，飲食量降低，體質(zhì)量明顯下降，目眥及耳廓蒼白，皮毛干枯無光澤。因灌胃和過量應(yīng)用麻醉藥等原因，5只大鼠死亡，最后剩下55只大鼠，即正常組15只、模型組12只、纈沙坦組14只和益腎方組14只。

3.2 模型復(fù)制情況分析 模型復(fù)制28 d后，模型復(fù)制組大鼠SCr、BUN、24hUPro與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示模型復(fù)制成功。見表1。

表1 造模28天后大鼠BUN、Scr和24hUPro比較

注：與正常組比較，#P<0.05

3.3 各組大鼠BUN、SCr、24hUPro水平比較 給藥8周后，模型組、纈沙坦組、益腎方組BUN、SCr、24hUPro水平均高于正常組(P<0.05)；與模型組比較，纈沙坦組和益腎方組BUN、SCr、24hUPro水平明顯降低(P<0.05)；與纈沙坦組比較，益腎方組BUN、SCr、24hUPro水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠BUN、SCr、24hUPro水平比較

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與纈沙坦組比較，△P<0.05

3.4 各組大鼠腎組織TGF-β1、HGF、α-SMA、FN蛋白表達(dá)水平比較 TGF-β1、α-SMA、FN蛋白在正常組有少量表達(dá)，模型組、纈沙坦組和益腎方組表達(dá)水平均高于正常組(P<0.05)；與模型組比較，纈沙坦組和益腎方組TGF-β1、α-SMA、FN蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)；與纈沙坦組比較，益腎方組TGF-β1、α-SMA、FN蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。HGF在正常組基本不表達(dá)，模型組、纈沙坦組和益腎方組HGF蛋白表達(dá)水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，纈沙坦組與益腎方組均顯著升高(P<0.05)；與纈沙坦組比較，益腎方組HGF蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 各組大鼠腎組織TGF-β1、HGF、α-SMA、FN蛋白表達(dá)水平比較(免疫組織化學(xué)染色，10×40倍)

組 別nTGF-β1/MOD值HGF/MOD值α-SMA/MOD值FN/MOD值正 常150.150±0.0090.011±0.0020.068±0.0070.092±0.042模 型120.245±0.034#0.073±0.026#0.224±0.076#0.139±0.003#纈沙坦140.198±0.023*0.297±0.005*0.169±0.008*0.123±0.003*益腎方140.172±0.014*△0.322±0.066*△0.152±0.007*△0.103±0.002*△

注：與正常組比較，#P<0.05；與模型組比較，*P<0.05；與纈沙坦組比較，△P<0.05

3.5 各組大鼠腎臟的組織形態(tài)學(xué)變化 正常組：腎臟組織結(jié)構(gòu)(腎小管、腎小球和腎間質(zhì))無病理改變。模型組：腎間質(zhì)內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤及纖維增生，間質(zhì)與小管分界不清；腎組織中可見腎小管萎縮、壞死與擴(kuò)張明顯，部分上皮細(xì)胞壞死；腎小球萎縮硬化、代償性擴(kuò)張及球囊壁粘連，小球數(shù)量減少。纈沙坦組：可見腎小管和部分腎小球中度擴(kuò)張、粘連，腎組織中炎性細(xì)胞浸潤和纖維組織中度增生。益腎方組：可見腎組織內(nèi)少量炎性細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)輕度纖維化，腎小管管腔輕度擴(kuò)張、部分萎縮壞死，腎小球輕度擴(kuò)張、部分粘連。見圖2。

4 討論

腎臟進(jìn)行性纖維化是CKD進(jìn)展至CRF的特征性病理過程。腎臟在各種致病因子(如炎癥、高血糖、高血壓、脂代謝紊亂)作用下，腎臟固有組織細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到損害，產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)并逐漸大量積聚[5]，導(dǎo)致腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化和腎內(nèi)血管硬化，取代正常腎臟結(jié)構(gòu)，造成腎臟喪失功能。延緩CRF進(jìn)展的關(guān)鍵是防止腎纖維化。腺嘌呤誘導(dǎo)的CRF模型是CRF的公認(rèn)模型，本研究顯示，模型組大鼠BUN、SCr顯著高于正常組，提示腎纖維化模型復(fù)制成功。

正常腎組織無FN表達(dá)，當(dāng)腎間質(zhì)出現(xiàn)病變時(shí)FN表達(dá)增強(qiáng)，其變化與ECM變化趨勢(shì)保持一致[6]，在ECM產(chǎn)生與沉積中發(fā)揮重要介導(dǎo)作用。α-SMA被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞表達(dá)的特征蛋白，參與腎臟纖維化形成[7]。在人腎組織研究中，發(fā)現(xiàn)腎小管間質(zhì)纖維化程度及腎功能惡化程度與腎小管間質(zhì)內(nèi)α-SMA表達(dá)水平呈正相關(guān)[8]。TGF-β是一種重要的促纖維化因子，在人體內(nèi)只有TGF-β1，主要在腎臟組織中表達(dá)，在腎纖維化中發(fā)揮著重要作用[9-10]。HGF是一種纖維化負(fù)性調(diào)節(jié)因子，它在腎小球系膜細(xì)胞、小管間質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)，以多種方式作用于腎小管上皮細(xì)胞，發(fā)揮保護(hù)腎臟功效[11]。HGF還可以減少腎組織ECM沉積，減輕腎小管與間質(zhì)纖維化[12]。

圖2 各組大鼠腎臟的組織形態(tài)學(xué)變化(10×40倍)

CRF病因病機(jī)復(fù)雜多變，脾腎虧虛為本、瘀濁蘊(yùn)結(jié)為標(biāo)[13]。曹恩澤認(rèn)為CRF的基本病機(jī)是以脾腎虧虛為本，濕濁壅阻為標(biāo)，瘀血貫穿病程始終，依此立“清降”“清補(bǔ)”和“活血通絡(luò)”法辨治CRF[14]。應(yīng)用計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)對(duì)曹恩澤診治CRF的臨床醫(yī)案予以辨證分型和處方用藥分析，總結(jié)出其運(yùn)用“清降補(bǔ)益通絡(luò)法”辨治CRF的基本方藥——十味芪黃益腎方[2]。方中生大黃清熱解毒、瀉下攻積，可使?jié)駶岫拘皬拇蟊愣?，為君藥。研究表明其有效成分大黃素可以通過促進(jìn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7的表達(dá)來發(fā)揮其抗腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程的作用[15]。黃芪為補(bǔ)氣要藥，可補(bǔ)脾、肺、腎之氣，研究顯示黃芪多糖可以抑制大鼠腎間質(zhì)纖維化的形成，保護(hù)腎臟[16]。蟲類藥物地龍、全蝎、僵蠶功專于活血通絡(luò)、搜剔驅(qū)邪，與黃芪共為臣藥。土茯苓解毒祛濕，槐米清熱涼血與土茯苓相須為用，蒼術(shù)燥濕健脾，三藥共為佐藥，助大黃清熱、降濁、解毒。煅龍骨與煅牡蠣為礦石類藥物，可以糾正患者的低鈣血癥和補(bǔ)充微量元素，且二藥煅制后收斂功效增強(qiáng)，增加其對(duì)腸道毒素的吸附作用，助君藥驅(qū)除毒邪而為佐使。

本研究結(jié)果顯示，十味芪黃益腎方可有效改善腺嘌呤腎纖維化CRF模型大鼠的腎功能，降低尿蛋白水平，減輕其腎臟病理損害；該方能減少模型大鼠腎間質(zhì)內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤，改善腎間質(zhì)纖維化和腎小球硬化程度。其作用機(jī)制可能與該方能下調(diào)腎纖維化過程中重要因子TGF-β1、α-SMA和FN水平，上調(diào)腎纖維化負(fù)性調(diào)節(jié)因子HGF的水平有關(guān)。