黃連水煎液微粒體系對大鼠小腸上皮細胞緊密連接結(jié)構(gòu)與緊密連接蛋白ZO-1表達的影響

徐慧慧，楊 曄，陳青青，任蓉蓉，尹登科，桂雙英

(安徽中醫(yī)藥大學藥學院，安徽 合肥 230012)

毛茛科植物黃連的干燥根莖，具有清熱、瀉火等功效[1]。從黃連中提取出的一種天然異喹啉類生物堿黃連素又稱小檗堿，具有清熱解毒、抗菌、抗腫瘤等藥理作用，已被廣泛應(yīng)用于臨床[2]。但由于小檗堿脂溶性差、溶解度低[3]，以及受到腸道外排轉(zhuǎn)運蛋白影響等因素的制約，存在口服吸收差、生物利用度低等問題[4]。

小檗堿主要以被動擴散的細胞旁路途徑被小腸上皮細胞攝取和轉(zhuǎn)運，其腸吸收效果主要取決于小腸上皮細胞間滲透性[5]。而小腸上皮細胞間滲透性主要由細胞間緊密連接決定。細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)由跨膜閉鎖蛋白(occludin)、緊密連接蛋白ZO-1(zonula occludens-1，ZO-1)、連接黏附分子(junction adhesion molecule, JAM)等組成[9]，其中ZO蛋白家族是最早被發(fā)現(xiàn)且被研究最為深入的緊密連接蛋白[10]。ZO-1蛋白表達的下調(diào)或活性降低，均會影響細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的完整性，從而調(diào)節(jié)腸黏膜屏障功能[11]。

隗麗等[6]研究發(fā)現(xiàn)，黃連水煎液中小檗堿的滲透性大于小檗堿單一成分，腸吸收效果得到明顯改善。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，中藥湯劑在煎煮過程中會形成許多以多糖、蛋白質(zhì)為主要物質(zhì)的微粒體系[7]，且中藥湯劑微粒體系可顯著促進經(jīng)細胞旁路途徑吸收的小分子藥物的腸吸收[8]。為闡明黃連湯劑微粒體系影響活性成分腸吸收的作用機制，本實驗以中藥材黃連與其活性成分小檗堿為研究對象，對其進行常規(guī)煎煮制備黃連水煎液，以此來研究水煎液微粒體系對大鼠小腸緊密連接結(jié)構(gòu)和相關(guān)蛋白ZO-1表達的影響。

1 材料

1.1 儀器 HL-2恒流泵：上海嘉鵬科技有限公司；ZD-88B恒溫搖床：江蘇省太倉市博萊特實驗儀器廠；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋：浙江省金壇市金城國勝實驗儀器廠；HT-7700透射電子顯微鏡：日本日立Hitachi；超博切片機：德國徠卡Leica；FD-ID-50冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；TG16-WS臺式高速離心機：湖南省長沙湘儀離心機儀器有限公司；ZEN3690激光散射粒度儀：英國Malvern公司；SPM-8100FM高分辨原子力顯微鏡：日本島津。

1.2 藥材、藥品與試劑 黃連：原中藥材經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學劉守金教授鑒定為毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch.)的干燥根；小檗堿原料藥(批號 YSBJ20170617，質(zhì)量分數(shù)≥98%)：英達試劑有限公司；山羊血清(批號 C0265)：碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗TJP1/ZO-1抗體(批號 PB0231)、濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(批號135911B)：武漢博士德生物公司；通用型試劑盒PV-6000：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；水為Mill-Q超純水；其余試劑均為分析純。

1.3 動物 健康成年SD大鼠24只，體質(zhì)量(220±30)g，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2017-002]提供。實驗前禁食12 h，自由飲水。

2 方法

2.1 黃連水煎液及其固體微粒、除微粒水煎液的制備 ①取黃連粗粉2.5 g于燒杯中，加50 mL蒸餾水，煮沸后文火煎煮1.5 h，4層紗布過濾；藥渣再次加50 mL蒸餾水，重復上述操作，合并兩次濾液，濃縮至10 mL，得黃連水煎液(全煎液)。②取2 mL黃連水煎液，離心(12 000 r/min，10 min)，取沉淀為黃連水煎液中固體微粒體系，以2 mL蒸餾水重懸，即為微粒懸浮液。③取2 mL黃連水煎液，依次經(jīng)過0.45、0.22、0.10 μm微孔濾膜濾過，去除微粒體系后，得到不含固體微粒的黃連水煎液(除微粒水煎液)。

2.2 黃連水煎液中固體微粒體系的表征 取“2.1”項中全煎液和微粒懸浮液經(jīng)過適當稀釋后用ZEN3690激光散射粒度儀檢測溶液中微粒的Zeta電位和粒徑分布(見圖1)。取“2.1”項中微粒懸浮液，SPM-8100FM高分辨原子力顯微鏡觀察其結(jié)果(見圖2)。

2.3 大鼠在體腸循環(huán)灌注實驗

2.3.1 腸循環(huán)灌注液配制 取全煎液、除微粒水煎液和微粒懸浮液各1 mL，蒸餾水稀釋250倍，然后配制成Kreb-Ringers(K-R)液，形成灌注體系為全煎液組、除微粒水煎液組和微粒懸浮液組。同時設(shè)置空白K-R液作為對照組。

2.3.2 手術(shù)方法 SD大鼠禁食(自由飲水)12 h后，腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉后固定，沿腹中線打開腹腔，暴露小腸，量取10 cm左右空腸(自幽門15 cm起往下10 cm止)，兩端切口，用預熱至37 ℃生理鹽水沖洗腸段內(nèi)容物后，切口兩端插管，結(jié)扎固定。傷口用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕，保溫37 ℃。以各組灌注液35 mL進行腸循環(huán)灌注，流速為0.2 mL/min，待灌注液分別灌滿腸道后開始計時，在2 h后取下腸段并處死大鼠。將取出的腸段用生理鹽水沖洗干凈，用鋒利的刀片取下約1 cm×1 cm大小的組織放入鋨酸固定液中固定，用于透射電子顯微鏡觀察。另取1 cm×1 cm的空腸組織，置于4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，用于ZO-1蛋白的免疫組織化學檢測。

2.4 透射電子顯微鏡下觀察小腸上皮細胞緊密連接結(jié)構(gòu) 將固定好的組織用磷酸緩沖液沖洗2次，每次20 min；4 ℃冰箱內(nèi)，使用50%、70%、80%、90%、100%的丙酮溶液進行逐級梯度脫水10 min；室溫下100%丙酮脫水10 min；37 ℃溫箱包埋，以混合包埋劑(包埋劑與丙酮比例分別為1∶1、3∶1)和純包埋劑各包埋1、3、5 h；于37 ℃溫箱12 h，60 ℃溫箱 36～48 h加溫聚合；用超薄切片機切片，再經(jīng)乙酸鈾和枸櫞酸鉛雙重染色法染色；于透射電子顯微鏡下觀察，隨機選取鏡下6個不同位置的細胞間縫隙，以Adobe Photoshop 10.0軟件計算細胞間縫隙寬度。

2.5 ZO-1蛋白的免疫組織化學法檢測 采取SABC法，將固定好的石蠟切片常規(guī)脫蠟、脫水；將組織切片浸入組織抗原修復液(0.01 mol/L枸櫞酸鈉溶液，pH 6.0)中，調(diào)節(jié)水溫達95 ℃左右，水浴20 min進行抗原熱修復，取出切片，自然冷卻到室溫；每張切片滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min，PBS緩沖液中沖洗3次，每次3 min；滴加10%山羊血清封閉液，室溫孵育20 min；滴加兔抗ZO-l多克隆抗體(1∶100)，4 ℃過夜16 h以上，PBST緩沖液沖洗3次，每次3 min；滴加HRP標記山羊抗小鼠IgG(1∶100)，37 ℃孵育20 min，PBST緩沖液沖洗3次，每次3 min；DAB顯色5 min，蘇木素復染后脫水、透明，中性樹脂封片，倒置電子顯微鏡下觀察蛋白陽性表達水平。每組隨機選擇6張較為清晰的切片，采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，測定各切片中陽性細胞的積分光密度。

3 結(jié)果

3.1 黃連水煎液中微粒體系的表征 如圖1所示，全煎液組雙峰粒徑分別為(162.2±24.3)、(1 106.0±38.9)nm，Zeta電位為(-21.40±0.26)mV；微粒懸浮液組雙峰粒徑分別為(191.8±22.4)、(1 025.0±32.5)nm，Zeta電位為(-22.3±0.18)mV，微粒粒徑均呈現(xiàn)出雙峰分布，其大小不一，分布范圍廣；電位值基本相同。全煎液組和微粒懸浮液組粒徑與Zeta電位比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，n=3)。結(jié)果說明微粒懸浮液可等同于全煎液中微粒體系。除微粒水煎液組未檢測到微粒存在。如圖2所示，中藥湯劑微粒的形態(tài)特征與粒徑檢測結(jié)果相一致，微粒大多為類圓形，粒徑分布范圍廣。

注：A1，全煎液組粒徑分布圖；A2，全煎液組表面Zeta電位分布圖；B1，微粒懸浮液組粒徑分布圖；B2，微粒懸浮液組表面Zeta電位分布圖

圖1 全煎液(A)和微粒懸浮液(B)的粒徑分布與表面Zeta電位

注：A. 微粒的二維掃描圖；B. 圖A中兩個較大微粒的高度圖；C. 圖A中黑色方框內(nèi)的三維放大圖；D. 圖C中微粒的高度圖

圖2微粒懸浮液的原子力顯微鏡檢測結(jié)果

3.2 透射電子顯微鏡下觀察小腸上皮細胞緊密連接結(jié)構(gòu)的變化 透射電子顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，空白對照組和去微粒水煎液組空腸上皮細胞與細胞間連接緊密，全煎液組和微粒懸浮液組空腸上皮細胞與細胞間連接縫隙增大，見圖3。全煎液組和微粒懸浮液組細胞間縫隙寬度顯著高于空白對照組與去微粒水煎液組(P<0.05)。見圖4。

3.3 免疫組織化學染色法觀察小腸上皮ZO-1蛋白表達水平 ZO-1蛋白均勻分布于腸上皮細胞周圍，呈蜂窩或者點狀聚集。與空白對照組比較，全煎液組和微粒懸浮液組ZO-1表達水平顯著降低(P<0.05)，去微粒水煎液組ZO-1表達水平無明顯變化(P>0.05)。

4 討論

腸上皮細胞通透性是藥物經(jīng)細胞旁路途徑轉(zhuǎn)運的主要影響因素，緊密連接是相鄰上皮細胞間最重要的連接方式。緊密連接結(jié)構(gòu)位于上皮細胞間的頂端，可以在細胞側(cè)空間形成調(diào)控屏障，調(diào)節(jié)水、離子和大分子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運。因此，緊密連接結(jié)構(gòu)對許多以被動擴散為主要方式穿過細胞間緊密連接的藥物跨膜轉(zhuǎn)運具有重要的調(diào)節(jié)作用。本實驗中小檗堿也屬于此類藥物。腸上皮細胞間緊密連接是由多種蛋白組成的一個多功能復合體，并受到體內(nèi)多個信號傳導通路的動態(tài)調(diào)節(jié)，從而實現(xiàn)對藥物、營養(yǎng)成分和病原體等的經(jīng)小腸滲透或攔截。藥物與其非活性成分一同經(jīng)口服后進入腸道，改變腸道內(nèi)微環(huán)境，激活腸道免疫系統(tǒng)并釋放某些效應(yīng)因子以調(diào)控上皮細胞緊密連接結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)活性藥物的經(jīng)細胞旁路途徑的轉(zhuǎn)運。

圖3透射電子顯微鏡下空白對照組(A)、全煎液組(B)、去微粒水煎液組(C)和微粒懸浮液組(D)大鼠空腸上皮細胞緊密連接結(jié)構(gòu)

注：與空白對照組比較，*P<0.05

圖5空白對照組(A)、全煎液組(B)、去微粒水煎液組(C)和微粒懸浮液組(D)大鼠空腸上皮細胞ZO-1蛋白表達水平(免疫組織化學染色，10×40倍)

注：與空白對照組比較，*P<0.05

本實驗結(jié)果顯示，黃連湯劑微粒體系可使上皮細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，細胞與細胞間的縫隙增大，免疫組織化學檢測結(jié)果也顯示腸上皮細胞緊密連接蛋白ZO-1的表達水平降低。這一結(jié)果表明，黃連水煎液固體微?？芍苯踊蜷g接影響細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)的改變，使細胞滲透性增加，促進小檗堿的腸吸收，這一結(jié)果與本課題組前期研究結(jié)果相一致。但黃連水煎液中微粒體對細胞間緊密連接結(jié)構(gòu)影響的具體機制尚不明確。根據(jù)本實驗結(jié)果推測，黃連水煎液固體微粒體系可以在一定程度上調(diào)控腸道屏障，使腸上皮細胞間的滲透性增加，從而促進小分子藥物的經(jīng)細胞旁路途徑的轉(zhuǎn)運，提高藥物的生物利用度。關(guān)于黃連多糖微粒影響腸上皮細胞通透性的吸收機制尚需進一步研究。