辛通暢絡(luò)法對(duì)膜性腎病*小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9及腫瘤壞死因子-α的影響

★ 王學(xué)軍 呂艷 支勇 曹式麗（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腎病科 天津 300193）

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 遠(yuǎn)交系健康雄性Balb/c小鼠（8周齡），SPF級(jí)，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK京2016-0002），其中MMP-9基因敲除小鼠由上海吉?jiǎng)P基因公司制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 陽離子化牛血清白蛋白（Chondrex公司）；弗氏不完全佐劑（Sigma公司）；MMP-9（武漢博士德生物工程有限公司）；TNF-α（尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)北京公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物 腎絡(luò)寧：由柴胡、黃芩、生黃芪、當(dāng)歸、女貞子、澤蘭、水蛭、細(xì)辛等組成，方藥經(jīng)煎煮濃縮成100mL汁液（含生藥1.05g/mL）。藥物購(gòu)自天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，加工由天津中醫(yī)藥大學(xué)藥廠協(xié)助完成。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組 實(shí)驗(yàn)小鼠共40只適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重分層隨機(jī)分為MMP-9基因敲除組、腎絡(luò)寧組、模型組各10只，各組均制備膜性腎病模型，余下10只作為空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)全程給予普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水。

2.2 模型復(fù)制 參考有關(guān)文獻(xiàn)復(fù)制采用陽離子化牛血清白蛋白（C-BSA）制備heymann膜性腎病小鼠模型［4］。預(yù)免疫：C-BSA 1mg，加入 0.5mL PBS中，再同等量的弗氏不完全佐劑混勻配制成乳白色懸濁液，在小鼠雙側(cè)腋下、腹股溝作多點(diǎn)皮下注射進(jìn)行預(yù)免疫。正式免疫：預(yù)免疫1周后，每只小鼠尾靜脈注射C-BSA 2.5mg（溶于lml pH值為7.4的PBS中），每周2次，共2周。

2.3 給藥方法 基因敲除組、腎絡(luò)寧組，自造模第1天起灌服腎絡(luò)寧（13.65g/kg）；模型組、對(duì)照組以等量生理鹽水灌胃。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行6周。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)與方法 于給藥后0周、第6周末檢測(cè)尿蛋白濃度；于給藥第0周自小鼠眶后靜脈竇取血，第6周末小鼠股動(dòng)脈取血，離心血清，進(jìn)行MMP-9、TNF-α的檢測(cè)。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用 SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果

3.1 尿蛋白的變化 實(shí)驗(yàn)前各組小鼠尿蛋白無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），第6周末模型組、腎絡(luò)寧組與基因敲除組小鼠尿蛋白均有不同程度明顯增加，腎絡(luò)寧組、基因敲除組小鼠尿蛋白明顯低于模型組（P＜0.05），且基因敲除組明顯低于腎絡(luò)寧組（P＜0.01）。見表 1。

表1 各組小鼠尿蛋白的變化（，n=10） mg/L

表1 各組小鼠尿蛋白的變化（，n=10） mg/L

注：與正常組比較，●P﹤0.05，●●P﹤0.05；與模型組比較，○P﹤0.05。

組別 0周 6周正常組 371.87±48.84 569.77±117.30模型組 359.08±16.60 1288.55±149.25●●腎絡(luò)寧組 366.24±81.00 824.74±94.62●○基因敲除組 327.44±27.08 916.51±82.18●○

3.2 血清MMP-9的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)前正常組、模型組及腎絡(luò)寧組小鼠MMP-9表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），而MMP-9基因敲除組MMP-9表達(dá)明顯降低（P＜0.01），第6周末模型組、腎絡(luò)寧組與基因敲除組小鼠MMP-9表達(dá)均有不同程度增加，腎絡(luò)寧組、基因敲除組明顯低于模型組（P＜0.05，P＜0.01），而腎絡(luò)寧組、基因敲除組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表 2。

表2 各組小鼠MMP-9的變化（） ng/mL

表2 各組小鼠MMP-9的變化（） ng/mL

注：與正常組比較，●P﹤0.05，●●P﹤0.01；與模型組比較，○P﹤0.05，○○P﹤0.01。與腎絡(luò)寧組比較，▼▼P＜0.01。實(shí)驗(yàn)中因溶血致基因敲除組剔除1只。

組別 例數(shù) 0周 6周正常組 10 3.16±0.71 3.02±0.95模型組 10 2.89±0.69 4.98±0.91腎絡(luò)寧組 10 2.67±0.56 3.88±0.04○基因敲除組 9 0.84±0.05●●○○▼▼ 1.86±0.13●○○▼▼

3.3 血清TNF-α的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)前正常組、模型組及腎絡(luò)寧組小鼠TNF-α表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），第6周末模型組、腎絡(luò)寧組、基因敲除組TNF-α表達(dá)均勻不同程度升高，其中腎絡(luò)寧組、基因敲除組低于模型組（P＜0.05），而腎絡(luò)寧組、基因敲除組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表3。

表3 各組小鼠TNF-α的變化（） pg/mL

表3 各組小鼠TNF-α的變化（） pg/mL

注：與正常組比較，●P﹤0.05；與模型組比較，○P﹤0.05。實(shí)驗(yàn)中因溶血致基因敲除組剔除1只。

組別 例數(shù) 0周 6周正常組 10 6059.36±1618.51 5617.87±704.88模型組 10 6170.74±848.94 9339.85±2469.29●腎絡(luò)寧組 10 6164.59±1605.22 7208.41±820.96●○基因敲除組 9 5939.25±431.36 7707.81±916.08●○

4 討論

MN是原發(fā)性腎小球疾病中最常見的病理類型，其病理以腎小球基底膜上皮細(xì)胞下彌漫的免疫復(fù)合物沉積，腎小球基底膜（GBM）增厚，腎小球?yàn)V過膜屏障的完整性受到破壞，從而出現(xiàn)大量蛋白尿。我們認(rèn)為MN的中醫(yī)病機(jī)關(guān)鍵為“少陽樞機(jī)不利，腎絡(luò)郁滯，虛實(shí)錯(cuò)雜”，并在長(zhǎng)期臨床基礎(chǔ)上制定了以“疏利少陽、辛通暢絡(luò)”為法的腎絡(luò)寧中藥復(fù)方制劑，方中柴胡、黃芩疏利少陽，樞轉(zhuǎn)氣機(jī)；黃芪、當(dāng)歸益氣補(bǔ)血，扶正理虛；細(xì)辛、水蛭辛通暢絡(luò)，化瘀消滯。諸藥協(xié)同，疏導(dǎo)調(diào)節(jié)，養(yǎng)臟和絡(luò)，促進(jìn)腎絡(luò)氣血調(diào)暢。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示腎絡(luò)寧能夠有效減少M(fèi)N小鼠尿蛋白排泄，改善蛋白質(zhì)代謝，提高血清蛋白水平。

在MN腎小球GBM病理過程中，MMP-9和TNF-α發(fā)揮重要作用。MMP-9是膠原酶，主要降解基膜膠原（Ⅳ型膠原），而Ⅳ型膠原是構(gòu)成GBM 最基本的骨架， MMP-9是導(dǎo)致腎小球基底膜IV型膠原的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，引起腎小球?yàn)V過屏障功能障礙，進(jìn)而產(chǎn)生大量蛋白尿的重要病理因素［5-6］，研究證實(shí)MMP-9參與了Heymann腎炎GBM 中Ⅳ型膠原的降解，導(dǎo)致GBM的破壞，且MMP-9的活性與腎小球GBM損傷程度相平行［7-8］，國(guó)內(nèi)臨床研究表明原發(fā)性膜性腎病患者腎組織MMP-9的表達(dá)明顯增強(qiáng)，提示MMP-9在腎臟疾病炎癥反應(yīng)過程中活性增加，導(dǎo)致GBM中Ⅳ型膠原過度降解，促進(jìn)GBM結(jié)構(gòu)破壞［9］。因此目前認(rèn)為MMP-9表達(dá)增加是引起MN腎小球毛細(xì)血管基底膜膠原降解、通透性增加，導(dǎo)致蛋白尿產(chǎn)生的重要致病因素［10］。TNF-α是免疫功能與機(jī)體炎性反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，腎內(nèi)多種細(xì)胞如系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞均具有產(chǎn)生和釋放TNF-α的能力。TNF-α作為促炎癥細(xì)胞因子可直接造成腎損傷，又可通過促進(jìn)其他炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，加重腎臟炎性損傷。如TNF-α刺激系膜細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基分泌過量的過氧化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，造成腎小球基底膜通透性的改變，導(dǎo)致尿蛋白形成［11］。前期研究顯示辛通暢絡(luò)法中藥復(fù)方可抑制家兔C-BSA膜性腎炎血中TNF-α的活性，降低腎小球基底膜通透性，減少尿蛋白［12］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組MMP-9表達(dá)升高，而腎絡(luò)寧組和MMP-9基因敲除組MMP-9表達(dá)降低，其中MMP-9基因敲除組尤為顯著。TNF-α檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組和MMP-9基因敲除組TNF-α表達(dá)升高，而腎絡(luò)寧組TNF-α表達(dá)降低，提示腎絡(luò)寧減少M(fèi)N小鼠尿蛋白排泄的作用，可能是通過降低TNF-α的表達(dá)，抑制MMP-9活性，達(dá)到改善腎小球GBM結(jié)構(gòu)和功能的損害，延緩MN的病理發(fā)展進(jìn)程。