水產(chǎn)源抗凍蛋白構(gòu)效關(guān)系及在食品加工儲(chǔ)藏中應(yīng)用的研究進(jìn)展

,,,,,,,*

(1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心,遼寧錦州 121013;2.蕭山出入境檢驗(yàn)檢疫局,浙江杭州 311208;3.浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,浙江杭州 310018;4.中國計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,浙江杭州 310018;5.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266100)

抗凍蛋白(antifreeze proteins,AFPs)最早是由Devries于1969年在南極海魚(TrematomasBorchgrevinki)的血液中提取而來[1],是一類有效預(yù)防低溫環(huán)境下生物體內(nèi)冰晶生長而損傷細(xì)胞,提高生物抗凍能力的蛋白質(zhì)類化合物總稱[2]。這類蛋白質(zhì)與Prism型晶面緊密結(jié)合,產(chǎn)生抗凍活性,降低冰晶的冰點(diǎn),造成冰點(diǎn)與熔點(diǎn)之間出現(xiàn)溫度差,該差值被稱為熱滯活性(thermal hysteresis activity,THA),抗凍活性可用熱滯值表示,熱滯值越大其抗凍活性越強(qiáng)。因而抗凍蛋白又稱為熱滯蛋白(thermal hysteresis protein,THPs)、冰結(jié)合蛋白(ice binding proteins,IBPs)或冰結(jié)構(gòu)蛋白(ice structuring proteins,ISPs)[3]?？箖龅鞍子捎谄涮厥獾臒釡?yīng)已被廣泛地應(yīng)用在食品加工儲(chǔ)藏運(yùn)輸、醫(yī)學(xué)細(xì)胞器官的超低溫保存以及相關(guān)農(nóng)業(yè)和工業(yè)等領(lǐng)域[4]。目前,國內(nèi)外關(guān)于抗凍蛋白的研究主要集中在魚類、昆蟲、植物、細(xì)菌及真菌上[5],尤其近年來植物源抗凍蛋白在食品中的應(yīng)用逐漸增多,魚源抗凍蛋白的研究雖已較為深入,但其它水產(chǎn)生物源抗凍蛋白的研究甚少。

本文將著重就水產(chǎn)源(魚、蝦、貝及其它水產(chǎn)生物)抗凍蛋白的構(gòu)效關(guān)系及其在食品加工儲(chǔ)藏中的應(yīng)用進(jìn)行綜述,旨在對水產(chǎn)源抗凍蛋白結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系進(jìn)行深入探討,為今后研究抗凍蛋白源的更多生物種類、更為有效地利用抗凍蛋白及擴(kuò)大生產(chǎn)應(yīng)用提供一定的理論借鑒。

1 水產(chǎn)源抗凍蛋白的構(gòu)效關(guān)系

1.1 魚源抗凍蛋白(Antifreeze protein,AFP)

魚類AFP是迄今為止研究最為廣泛和透徹的一類蛋白,按照氨基酸序列和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不同,可分為六類:Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型、抗凍糖蛋白(antifreeze glycoprotein,AFGP)和高活性抗凍蛋白(hyperactive antifreeze protein,HAFP)[2]。紀(jì)瑞慶等[6]對魚源六種AFP結(jié)構(gòu)和抗凍活性間的關(guān)系做了詳細(xì)的綜述。表1總結(jié)了六種魚類AFP的相對分子質(zhì)量、熱滯活性、氨基酸序列、二級(jí)結(jié)構(gòu)特征、三維結(jié)構(gòu)圖形、同源蛋白、Protein data bank(PDB)ID、代表性物種。由表1中可以看出,不同抗凍蛋白的熱滯活性不同,且熱滯值越高,其抗凍活性越高。鑒于其獨(dú)特的功能,AFP可以提升細(xì)胞在冰凍脅迫下抗結(jié)冰能力,減緩小冰晶相互結(jié)合的速率,修飾冰晶形態(tài),抑制反復(fù)凍融造成的重結(jié)晶現(xiàn)象,降低過冷卻點(diǎn),保護(hù)細(xì)胞膜。使生物體具有抗寒能力和抗凍的作用,避免了低溫對生物造成不可修復(fù)的傷害,還可調(diào)節(jié)原生質(zhì)體過于寒冷狀態(tài)。

表1 魚源抗凍蛋白的結(jié)構(gòu)和特征Table 1 Structure and characteristics of antifreeze proteins from fish species

1.2 蝦、貝源AFP構(gòu)效關(guān)系

迄今為止,蝦、貝源AFP的研究較少,劉志東等[20]及馬慶保等[21]以南極磷蝦(Euphausiasuperba)為原料,以AFP得率為指標(biāo),采用特異性親和吸附法提取南極磷蝦AFP,差示掃描量熱法(differential scanning calorimetry,DSC)評(píng)價(jià)南極磷蝦AFP的熱滯活性。結(jié)果表明,南極磷蝦AFP的預(yù)測得率為30.12%,分子量約為76 kDa,THA為1.76 ℃。研究發(fā)現(xiàn)[13],AFP的冰晶結(jié)合位點(diǎn)是相對疏水的,將AFP溶解于水中,其冰晶結(jié)合位點(diǎn)可能無法完全展開,活性受到抑制,造成THA的下降。因此,可將AFP溶于低鹽溶液以提高抗凍活性。Carvajal-Rondanelli等[22]從藍(lán)貽貝(Mytilus edulis)中提取到AFGP,經(jīng)研究它是由三肽單元[-Ala-Ala-Thr(雙糖基)-]重復(fù)串聯(lián)而成的糖蛋白,研究表明,糖基經(jīng)過乙?；瓦^氧化等化學(xué)處理后,該AFGP表現(xiàn)為無抗凍活性,因此認(rèn)為糖基是抗凍活性形成的主要基團(tuán)。其在溶液中以反平行左手α-螺旋存在,其中疏水基團(tuán)面向碳骨架,而親水基團(tuán)面向溶液。研究表明,其抑制冰晶結(jié)晶的機(jī)理為:溶液中的親水基團(tuán)和小分子形成氫鍵,阻止了冰核的形成,并且它們的抗凍活性與AFP相對分子量成正相關(guān)[4]。

1.3 其它水產(chǎn)生物AFP構(gòu)效關(guān)系

目前,國內(nèi)外對其它水產(chǎn)生物,如水產(chǎn)無脊椎動(dòng)物和海藻等水產(chǎn)生物中AFP的研究尚少。Wilkins等[23]首次報(bào)道了海洋無脊椎動(dòng)物海綿(Hamaxinellabalfourensis)的親水提取液在水的晶體形態(tài)上表現(xiàn)出非依數(shù)性降低冰點(diǎn)的作用。利用反相高壓液相色譜法對提取液進(jìn)行純化,用基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜法和氨基酸測序鑒定結(jié)構(gòu)分離出主要肽,并對其進(jìn)行測定,結(jié)果表明該物質(zhì)具有較強(qiáng)的非平衡抗凍活性,相對分子量為2.5 kDa,此類蛋白可能為一種新型的AFP。2009年,Raymond等[24]對南極雪藻擬衣藻進(jìn)行了研究,一共分析了1300個(gè)表達(dá)序列標(biāo)記(expression sequence tag,EST),發(fā)現(xiàn)南極雪藻體內(nèi)存在抗凍活性的功能基因。王興娜[25]研究發(fā)現(xiàn)南極冰藻因具有獨(dú)特的抗凍基因調(diào)節(jié)機(jī)制,使其可以生存于寒冷、干燥、高鹽、強(qiáng)福射的極地海冰氣候環(huán)境。該課題組利用實(shí)時(shí)定量PCR研究了16種基因在冷凍脅迫條件下的表達(dá)變化,并對其中一條抗凍蛋白基因進(jìn)行了異源表達(dá),深入研究其功能。將AFP基因成功轉(zhuǎn)化到大腸桿菌并成功表達(dá),發(fā)現(xiàn)大部分AFP以包涵體形式存在,并顯著提高了大腸桿菌的抗凍能力。又進(jìn)一步將AFP轉(zhuǎn)入萊茵衣藻中,發(fā)現(xiàn)部分重組藻株的抗凍活性略有增強(qiáng)。Raymond等[26]還在南極綠藻、雪藻、衣藻、苔蘚和藍(lán)藻中提取出具有抑制冰重結(jié)晶半純品的冰活性物質(zhì),對該物質(zhì)進(jìn)行加熱處理,其抑制冰晶重結(jié)晶的能力降低。因此,推測該物質(zhì)可能為某種AFP,通過與冰特定結(jié)合而抑制冰重結(jié)晶。其中衣藻AFP能特異性地同時(shí)結(jié)合到冰晶的棱面和基面,使冰晶沿a軸生長,結(jié)果使冰晶呈盤狀,其抗凍活性更高,被稱為高活性抗凍蛋白[4]。由此表明,不同來源的AFP結(jié)構(gòu)有明顯區(qū)別,但是其抗凍機(jī)制主要是通過與冰特定的結(jié)合作用而實(shí)現(xiàn)的。

2 AFP在食品加工儲(chǔ)藏中的應(yīng)用

2.1 AFP在水產(chǎn)品中的應(yīng)用

2.1.1 AFP在轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)品加工中的應(yīng)用 由于天然提取的AFP含量較低,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)人工合成AFP已在很多領(lǐng)域?qū)嵭?。Fletcher等[27]首次將美洲擬鰈(Pseudopleuronectesamericanus)血淋巴AFPⅠ直接注入虹鱒魚(Salmogairdneri)體內(nèi),結(jié)果顯示虹鱒魚產(chǎn)生抗凍活性,且AFP沒有受體種屬特異性。之后我國研究人員利用AFP轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高水產(chǎn)生物的耐低溫性,并對此做了許多研究。如,李衛(wèi)東等[28]構(gòu)建了美洲大綿鳚(Macrozoarcesamericanus)中的一種AFP Ⅲ(HPLC-12)表達(dá)基因載體,并借此載體通過轉(zhuǎn)基因的方法快速培育南方重要經(jīng)濟(jì)貝類—雜色鮑耐低溫新品種,研究結(jié)果表明HPLC-12抑制冰晶重結(jié)晶活性最高,此亞型在酵母細(xì)胞中表達(dá)后,產(chǎn)生亞基單體蛋白,這種單體蛋白相對于其他的二聚體或多聚體AFP具有明顯的優(yōu)越性,不需要蛋白酶或其它化學(xué)物質(zhì)的催化即可直接產(chǎn)生抗凍活性。楊敏等[29]將從南極魚綿鳚科中提取的多聚AFP Ⅲ基因克隆得到AFP Ⅲ的四聚體,并構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒,篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系,將其轉(zhuǎn)到斑馬魚細(xì)胞系中,發(fā)現(xiàn)AFP Ⅲ的四聚體基因可以在斑馬魚細(xì)胞系中大量表達(dá),并且能夠能顯著增強(qiáng)細(xì)胞的抗寒能力,減少斑馬魚細(xì)胞在低溫脅迫下的死亡率。利用AFP進(jìn)行水產(chǎn)生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功的案列還有:將抗凍蛋白通過基因工程技術(shù)應(yīng)用在不耐寒的水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物羅非魚體內(nèi),使其具有抗寒性,不僅延長了羅非魚的生長期,還擴(kuò)大了養(yǎng)殖范圍,提高了產(chǎn)量[4]。由于低溫對水產(chǎn)生物的影響限制了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展,然而抗凍蛋白的發(fā)現(xiàn)和生物技術(shù)的發(fā)展為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)提供了廣闊的發(fā)展前景。另外,轉(zhuǎn)AFP基因的水產(chǎn)品還有遮目魚、鮭魚、鯪魚、金魚及羅氏沼蝦等。這些耐低溫的水產(chǎn)新品種不僅對促進(jìn)水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物轉(zhuǎn)基因育種工作的開展具有重要意義,而且可以改變當(dāng)前的養(yǎng)殖范圍,降低生產(chǎn)成本,提高經(jīng)濟(jì)效益[5]。因此,將AFP應(yīng)用在轉(zhuǎn)基因水產(chǎn)品加工領(lǐng)域具有重要的意義。

2.1.2 AFP在水產(chǎn)品凍結(jié)或凍藏中的應(yīng)用 低溫冷鏈物流是水產(chǎn)品生產(chǎn)、運(yùn)輸過程中不可或缺的環(huán)節(jié),在此期間,水產(chǎn)品會(huì)經(jīng)歷解凍、凍結(jié)、解凍等循環(huán)反復(fù)凍融過程,其內(nèi)部水分子會(huì)經(jīng)歷冰晶形成和重結(jié)晶等現(xiàn)象,導(dǎo)致細(xì)胞汁液流失,體液局部濃縮,細(xì)胞組分變化和蛋白質(zhì)變性。這些現(xiàn)象會(huì)嚴(yán)重降低水產(chǎn)品品質(zhì)[30]。在水產(chǎn)品冷凍加工和儲(chǔ)藏時(shí),冷凍的溫度及速度會(huì)引起冷凍產(chǎn)品的組成成分及產(chǎn)品質(zhì)量發(fā)生變化。如冷凍魚糜冷凍過程中,食品內(nèi)部水分子會(huì)產(chǎn)生冰晶,若冷凍速度過慢,造成冰晶過大,蛋白質(zhì)變性,食品營養(yǎng)價(jià)值降低[4]。但是,在凍結(jié)或凍藏水產(chǎn)品中添加AFP,可以有效降低解凍水產(chǎn)品的汁液流失率,蛋白質(zhì)氧化、變性及聚集程度,提高冷凍制品的品質(zhì)。

譚昭儀等[31]研究了在24周的凍藏周期內(nèi),添加新型AFP對鳙魚魚糜凝膠強(qiáng)度及蛋白質(zhì)冷凍變性的影響。結(jié)果表明,在魚糜凍藏前添加AFP,可以抑制鹽溶性蛋白在凍藏過程中的變性,保持魚糜良好的凝膠特性。Ohta等[32]研究發(fā)現(xiàn),向凍藏的魚肉中添加脯氨酸可以抑制Ca2+-ATPase活性的降低,提高冷凍魚肉的保水性。這可能是因?yàn)楦彼崾沟冒裨诘鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)中的AFP基團(tuán)被釋放出來,提高冷凍品的耐儲(chǔ)藏能力,防止其冷凍變性,改善產(chǎn)品品質(zhì)。宋麗麗等[33]研究了12% NaCl和0.2 mol/L AFP混合抗凍液浸漬，對不同凍藏溫度下的斑點(diǎn)叉尾鮰魚片解凍后品質(zhì)和蛋白質(zhì)變性的影響。結(jié)果表明,由于AFP具有非依數(shù)性的降低冰點(diǎn),抑制冰晶生長速度的特性,添加AFP可以降低解凍鮰魚片的pH,減少解凍后水分流失,維持較低的K值和揮發(fā)性鹽基氮含量,緩解脂肪氧化,保持較高的鹽溶蛋白含量和Ca2+-ATP酶活性。因此,AFP可有效保持解凍鮰魚片較好的品質(zhì),減輕解凍鮰魚片蛋白質(zhì)冷凍變性的程度。另外,還可以將AFP通過直接混合、浸泡、真空滲透或制備抗凍液等方法，應(yīng)用于水產(chǎn)品的冷凍及解凍加工過程中,使內(nèi)部水分子形成均勻的小冰晶,抑制重結(jié)晶,減少細(xì)胞損傷以及防止蛋白質(zhì)變性而引起的肉質(zhì)持水能力下降,改善水產(chǎn)品在解凍過程中常出現(xiàn)的汁液流汁、軟爛等問題,提高水產(chǎn)品質(zhì)量[4]。

2.2 AFP在肉制品中的應(yīng)用

豐富多樣的加工肉制品越來越受到廣大消費(fèi)者青睞。但加工肉制品的理化性質(zhì)、營養(yǎng)成分和食用安全性易受各種加工及貯藏環(huán)境因素的作用而產(chǎn)生變化,如蛋白質(zhì)變性和脂質(zhì)氧化等。將AFP應(yīng)用到肉制品儲(chǔ)藏加工中,可有效提高產(chǎn)品品質(zhì)。Yeh等[34]從乳酸鏈球菌中生產(chǎn)并重組了一種新型AFP,并將之添加在冷凍豬肉中,對解凍后體積、形狀、顏色、質(zhì)地、氣味和接受度進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果表明添加AFP的豬肉汁液流失少,色澤質(zhì)地較好,感官評(píng)價(jià)分?jǐn)?shù)較高。微觀結(jié)構(gòu)中可以看出添加AFP的冷凍豬肉,細(xì)胞內(nèi)冰晶較小,組織結(jié)構(gòu)較完整。對冷凍豬肉的品質(zhì)研究表明,AFP可以防止蛋白含量降低,減少營養(yǎng)流失,提高冷凍肉制品品質(zhì)。Payne等[35]在羔羊宰殺之前,將南極鱈魚AFGP注射入其體內(nèi),宰后-20 ℃冷凍儲(chǔ)藏,掃描電鏡(scanning electron microscope,SEM)觀察解凍羊肉微觀結(jié)構(gòu),結(jié)果發(fā)現(xiàn),在屠宰前1 h或24 h注射AFPG,都可有效減小冰晶體積,抑制重結(jié)晶現(xiàn)象,且減小程度與冷凍前浸泡AFGP的濃度和浸泡時(shí)間有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明在宰前24 h注射AFPG,且注射濃度為0.01 mg/kg時(shí)可有效減少滲水情況,羊羔肌肉中所形成的冰晶達(dá)到最小,保持了肉制品原有結(jié)構(gòu),營養(yǎng)成分流失最少。Boonsupthip[36]的研究則表明在冷凍和冷藏期間,III型AFP明顯保留了羅非魚肌動(dòng)球蛋白Ca2+-ATP酶活性,有效阻止冷凍羅非魚肉中肌肉蛋白形成凝膠狀,抑制了冷凍肉的重結(jié)晶現(xiàn)象。結(jié)果顯示,AFP III對冷凍羅非魚肉的保護(hù)作用更是優(yōu)于傳統(tǒng)的低溫保護(hù)劑(蔗糖-山梨糖醇混合物)。另外,解凍時(shí),把畜禽肉浸泡在AFP溶液中也可明顯減少冰晶的生成,抑制重結(jié)晶帶來的汁液流失,水分遷移,蛋白質(zhì)氧化和細(xì)胞損傷,從而保持產(chǎn)品品質(zhì)和風(fēng)味[30]。

2.3 AFP在冷凍面團(tuán)中的應(yīng)用

面團(tuán)在冷凍狀態(tài)下便于保藏和運(yùn)輸,得以迅速發(fā)展。然而,冷凍面團(tuán)在凍藏過程中,表面失水使得內(nèi)部水分緩慢移動(dòng)到表面,造成面團(tuán)中水分的喪失,使其表面產(chǎn)生皺縮、裂紋等現(xiàn)象,影響冷凍面團(tuán)品質(zhì)及外觀[37]。另外,溫度波動(dòng)造成冷凍面團(tuán)中冰晶產(chǎn)生重結(jié)晶,破壞面筋蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),降低冷凍面團(tuán)品質(zhì),使其醒發(fā)時(shí)間延長、比容減少[38]。研究表明,可以通過添加冷凍保護(hù)劑來改善面團(tuán)品質(zhì)。AFP作為一類新型的食品添加劑,可以有效降低冷凍面團(tuán)在冷藏過程中產(chǎn)生的負(fù)面影響,目前發(fā)現(xiàn)的此類AFP源有水產(chǎn)生物、大麥籽粒、冬麥草、燕麥、歐白英以及胡蘿卜等[39]。

將水產(chǎn)源AFP應(yīng)用于冷凍面團(tuán)中,可顯著改善產(chǎn)品的口感和營養(yǎng)價(jià)值。姬成宇等[40]研究了凍藏和凍融循環(huán)下魚源AFP對冷凍面團(tuán)的蛋白質(zhì)特性以及水分子存在狀態(tài)的影響,結(jié)果表明,AFP能夠抑制二硫鍵的斷裂和二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，且降低凍融循環(huán)過程中面團(tuán)水分的流動(dòng)性,減少水分的遷移,有效的提高了面團(tuán)的持水能力。另外,AFP的冰晶形態(tài)修飾作用和抑制重結(jié)晶效應(yīng)均會(huì)減小酵母和面筋結(jié)構(gòu)受破壞的程度,提高恒溫凍藏下預(yù)發(fā)酵冷凍面團(tuán)的比容,抑制酵母凍藏和凍融過程中產(chǎn)氣力,提高面團(tuán)的持氣能力[40]。Panadero等[41]提取了極地杜父魚(Myoxocephalus aenaeus)的AFP,并在工業(yè)釀酒酵母菌株中合成并重組成一種Ⅰ型AFP GS-5,在面包酵母中,GS-5的外源表達(dá)增加了冷凍耐受性,并在冷凍面團(tuán)中增強(qiáng)了產(chǎn)氣能力,減弱了凍融循環(huán)過程對冷凍面團(tuán)面筋結(jié)構(gòu)的弱化作用，并有效保護(hù)冷凍面團(tuán)超微結(jié)構(gòu),總之,冷凍面團(tuán)中魚源AFP的表達(dá)可有效增加酵母細(xì)胞的活力,提高冷凍面團(tuán)的品質(zhì)。李靈等[42]通過將鯊魚源AFP添加到馬鈴薯面團(tuán)中,研究在凍融循環(huán)條件下AFP對冷凍馬鈴薯面團(tuán)品質(zhì)的保護(hù)作用。結(jié)果表明,添加1% AFP可使馬鈴薯面團(tuán)比容增大、發(fā)酵時(shí)間縮短、淀粉糊化度減弱、失水率降低,馬鈴薯饅頭的硬度、咀嚼性和膠粘性都顯著低于對照組,核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)分析顯示AFP可以影響冷凍馬鈴薯面團(tuán)中的水分狀態(tài),使深層結(jié)合水含量增加,半結(jié)合水含量減少,還能抑制水分流失,提高馬鈴薯面團(tuán)的持水力。因此,AFP可作為冷凍馬鈴薯面團(tuán)產(chǎn)品的低溫保護(hù)劑。另外,將AFP應(yīng)用在速凍面食,如湯圓、水餃中,可有效減少其營養(yǎng)物質(zhì)的損失,提高速凍食品品質(zhì)。單從硬度值上對AFP的應(yīng)用價(jià)值考量,2.5%的AFP添加量是速凍湯圓的最佳添加量,與空白實(shí)驗(yàn)相比,添加AFP的湯圓呈現(xiàn)較光滑的外觀且濁度降低,渾湯清晰透明,易被人們所接受[3]。

2.4 AFP在果蔬中的應(yīng)用

2.4.1 AFP在轉(zhuǎn)基因果蔬加工中的應(yīng)用 果蔬在栽培、種植以及收獲后低溫保鮮儲(chǔ)藏和速凍加工過程中都會(huì)遭受冷害。但是,傳統(tǒng)的育種方法抗寒效果不佳,而轉(zhuǎn)抗凍基因的果蔬品種則表現(xiàn)出良好的耐寒性,還可擴(kuò)大種植范圍,延長貨架期。因此,近年來關(guān)于轉(zhuǎn)AFP基因的果蔬品種逐漸增多。美國DNAP公司將水產(chǎn)源AFP通過基因工程使其在番茄中表達(dá),培育出耐寒番茄新品種。研究發(fā)現(xiàn)AFP不僅降低了細(xì)胞內(nèi)水分的凝固,還增加了細(xì)胞的存活率,該轉(zhuǎn)基因番茄能在-6 ℃生存幾個(gè)小時(shí),并且其果實(shí)冷藏后不變形[5]。將冬季比目魚AFP基因通過真空透析導(dǎo)入馬鈴薯、擬南芥和油菜中后,發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)AFP基因生物的冰點(diǎn)降低了1.8 ℃,也證實(shí)了通過轉(zhuǎn)基因技術(shù),培育耐寒性植物的可行性[5]。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)和分子生物學(xué),使抗凍基因在目標(biāo)果蔬中表達(dá),其中成功案例還包括轉(zhuǎn)AFP基因甜菜、柑橘、草莓、甘蔗、甜椒、葡萄等,這些轉(zhuǎn)AFP基因的果蔬經(jīng)研究表明具有耐寒性和耐儲(chǔ)藏性[30]。

2.4.2 AFP在果蔬儲(chǔ)藏中的應(yīng)用 一般來說,果蔬貯藏時(shí)的溫度越低,品質(zhì)保持的越好,貯藏溫度若能降低1 ℃,就可以明顯延長某些果蔬的貯藏壽命[43]。新鮮果蔬貯藏時(shí)均需有適宜的最低溫度,其貯藏的低溫臨界溫度因品種不同而異,低于此溫度會(huì)造成果蔬的冷害和凍害。速凍果蔬在凍藏解凍過程中常出現(xiàn)汁液流失、軟爛、失去原有形態(tài)等問題,因此,AFP在果蔬的冬季貯存和保鮮中有重要的應(yīng)用價(jià)值。Ruims等[44]研究了Ⅰ型AFP通過真空浸漬(58 KPa,5 min)于豆瓣菜中,通過色差、掃描電鏡和萎蔫試驗(yàn)來評(píng)價(jià)AFP對豆瓣菜形態(tài)品質(zhì)的影響。結(jié)果表明,經(jīng)過真空浸漬AFP的樣品,細(xì)胞壁更清晰,細(xì)胞形狀更圓潤,添加AFPⅠ的葉子具有更高的透氣性,另外,AFP還可以降低豆瓣菜在冷凍過程中的冰晶尺寸、抑制再結(jié)晶現(xiàn)象,有效提高了凍藏蔬菜的品質(zhì)。因此AFP可作為在冷凍食品,尤其綠葉蔬菜中重要的食品添加劑。Kong等[45-46]就AFP預(yù)處理對胡蘿卜和櫻桃質(zhì)構(gòu)、汁液流失、冰晶形態(tài)大小以及揮發(fā)性化合物的影響做了綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,在冷凍過程中,AFP對果蔬冰晶形態(tài)進(jìn)行了修飾。AFP預(yù)處理降低了凍藏和解凍過程對胡蘿卜和櫻桃造成的汁液流失以及對顏色和質(zhì)構(gòu)等物理特性的影響,抑制總花青素、揮發(fā)性物質(zhì)、酚醛和抗氧化等成分的損失,提高了冷凍果蔬的品質(zhì),證實(shí)了其在體外的抗凍活性,從而證明了AFP在冷凍食品中的應(yīng)用潛力。因此,AFP可在果蔬儲(chǔ)藏及運(yùn)輸過程中減少汁液流失和營養(yǎng)成分的損失、減少細(xì)胞損傷以及保持食品質(zhì)地。

2.5 AFP在乳制品中的應(yīng)用

冰淇淋的加工和儲(chǔ)藏過程中,冰晶感會(huì)嚴(yán)重破壞冰淇淋的質(zhì)地和口感,因此控制冰淇淋中冰晶的尺寸、形狀及分布可以有效改善冰淇淋的組織細(xì)膩程度,冰晶越小、分布越均勻,其口感越柔軟細(xì)膩[47]。但是冰淇淋在凝凍、硬化、貯藏和運(yùn)輸過程難免遇到溫度波動(dòng),不斷的解凍和凍結(jié)現(xiàn)象會(huì)造成冰晶增大和重結(jié)晶現(xiàn)象,導(dǎo)致冰淇淋質(zhì)地粗糙,口感不佳。美國DNAP公司將AFP添加于冰淇淋和冰奶中,消除了冰渣,改善了產(chǎn)品的質(zhì)量和口感[30],因此可以證明AFP是潛在的冷凍乳制品添加劑。在冰淇淋的加工過程中,將傳統(tǒng)的硬化步驟用1～100 mg/L的AFP添加到冷凍混合物中來替代時(shí),結(jié)果發(fā)現(xiàn)可有效降低冰晶的重結(jié)晶率,改善成品的口感細(xì)膩度[48]。在探究AFP對冰淇淋口感的影響時(shí),把少量的AFP加入到已融化的冰淇淋樣品中,于-80 ℃下迅速冷凍,在-6～-8 ℃下放置1 h后,可觀察到,與對照相比,添加AFP的樣品中冰晶明顯變小[30]。研究表明,將AFP添加到冷凍乳品如冰奶、冷凍酸奶、軟香乳凍、冰凍果子露以及冷凍甜食如冰糕、冰沙、冷凍果漿中,能夠形成一種牢固的、密集的連續(xù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),有效抑制了冷凍乳制品在儲(chǔ)存過程中冰晶的形成和重結(jié)晶等現(xiàn)象,使其品質(zhì)得到顯著的改善[30]。將AFP應(yīng)用在乳制品中,可有效降低冰渣對產(chǎn)品的影響,提高產(chǎn)品的細(xì)膩潤滑度,使其口感更佳,質(zhì)量更好。

3 結(jié)論與展望

抗凍蛋白因具有熱滯活性、修飾冰晶形態(tài)、抑制冰晶重結(jié)晶、降低過冷卻點(diǎn)和保護(hù)細(xì)胞膜等作用而具有廣闊的應(yīng)用前景[3]。目前,對抗凍蛋白的作用機(jī)理及應(yīng)用雖已有較為深入、廣闊的研究,但由于其提取率低、性質(zhì)不穩(wěn)定,而人工合成又存在成本高、安全性等問題使其在規(guī)模化生產(chǎn)應(yīng)用方面受到很大限制[30]。未來應(yīng)通過基因工程和分子生物學(xué)等方法手段共同致力于抗凍蛋白的應(yīng)用研究,實(shí)現(xiàn)低成本、高質(zhì)量、大規(guī)模的抗凍蛋白開發(fā),將抗凍蛋白應(yīng)用在食品加工和儲(chǔ)藏中,以期減少細(xì)胞損傷和營養(yǎng)流失,保持產(chǎn)品品質(zhì)和風(fēng)味,提高食用安全性等。因此,隨著科學(xué)的進(jìn)步,抗凍蛋白將在食品工業(yè)、生物材料的保存、醫(yī)藥領(lǐng)域、抗寒性相關(guān)轉(zhuǎn)基因工程甚至更廣闊的領(lǐng)域有更為廣泛的應(yīng)用。