氣相色譜三重四級桿串聯(lián)質譜同時測定香精中22種鄰苯二甲酸酯

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(1.浙江方圓檢測集團股份有限公司,浙江杭州 310018;2.浙江省產(chǎn)品質量安全檢測研究院,浙江杭州 310018;3.浙江大學生物系統(tǒng)工程與食品科學學院,智能食品加工技術與裝備國家地方聯(lián)合工程實驗室,浙江杭州 310058)

鄰苯二甲酸酯(PAEs)是通常被稱為塑化劑的一類物質,從上世紀30年代開始,它就作為增塑劑并使用在工業(yè)產(chǎn)品中,從而增加塑料制品的透明度,耐久性,彈性和壽命[1-2],其中包括個人護理品、藥物、食品包裝、營養(yǎng)補充劑等[3]。但是研究發(fā)現(xiàn)鄰苯二甲酸酯具有生物毒性,它會干擾內分泌系統(tǒng)、免疫和神經(jīng)的正常調節(jié),并具有致突變、致畸性和致癌的特性[4]。由于它的作用與激素相似,并且可以模擬雌激素效應,因此又被稱作環(huán)境激素。

目前,鄰苯二甲酸酯前處理方法主要有固相萃取法[5],固相微萃取法[6],磁固相萃取法[7]和液液(微)固相萃取法[8]等。其中固相萃取法因其成本低,凈化效果好和操作簡便等特點,成為較為常用的萃取方法。氣相色譜[9-10]、氣相色譜-串聯(lián)質譜法[11-12]、液相色譜[13]和液相色譜-串聯(lián)質譜法[14-15]是鄰苯二甲酸酯主要的測定方法。但是由于液相色譜的管路本底較高,準確定量較為困難,氣相色譜-質譜技術成為主要的鄰苯二甲酸酯檢測方法[16]。香精由多種香料混合而成,常添加于飲料、果凍和餅干等食品當中。2011年爆發(fā)的臺灣飲料塑化劑事件中,就涉及到香精,使得香精的塑化劑問題得到社會關注。香精內部成分復雜,并且部分香精由油溶性組分組成,致使結果存在著假陽性風險。單四級桿質譜選擇性較差,定量限較高,難以滿足香精中鄰苯二甲酸酯的檢測要求。本實驗采用固相萃取方式對香精樣品進行前處理,使用氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜對其進行測定,以期降低背景干擾,減小假陽性風險,提高檢測靈敏度,為實現(xiàn)香精中22種鄰苯二甲酸酯的快速、準確分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

22種鄰苯二甲酸酯類混合標準品:鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二異丙酯(DIPrP)、鄰苯二甲酸二烯丙酯(DAP)、鄰苯二甲酸二丙酯(DPrP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯(DMEP)、鄰苯二甲酸二異戊酯(DIPP)、鄰苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(BMPP)、鄰苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP)、鄰苯二甲酸二戊酯(DPP)、鄰苯二甲酸二己酯(DHXP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(DBEP)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二正庚酯(DHP)、鄰苯二甲酸二苯酯(DPhP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、鄰苯二甲酸二癸酯(DIDP)、鄰苯二甲酸二壬酯(DNP) 原始濃度均為1000 μg/mL,上海安譜實驗科技股份有限公司;16種鄰苯二酸甲酸酯類內標物:鄰苯二甲酸二甲酯-D4(DMP-D4)、鄰苯二甲酸二乙酯-D4(DEP-D4)、鄰苯二甲酸二異丁酯-D4(DIBP-D4)、鄰苯二甲酸二丁酯-D4(DBP-D4)、鄰苯二甲酸二(2-甲氧基)乙酯-D4(DMEP-D4)、鄰苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯-D4(BMPP-D4)、鄰苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯-D4(DEEP-D4)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯-D4(BBP-D4)、鄰苯二甲酸二己酯-D4(DHXP-D4)、鄰苯二甲酸二戊酯-D4(DPP-D4)、鄰苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯-D4(DBEP-D4)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯-D4(DCHP-D4)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯-D4(DEHP-D4)、鄰苯二甲酸二苯酯-D4(DPhP-D4)、鄰苯二甲酸二正辛酯-D4(DNOP-D4)、鄰苯二甲酸二壬酯-D4(DNP-D4) 德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司;正己烷、丙酮、乙腈 色譜純,美國TEDIA公司;40種香精樣品 均來自浙江省香精生產(chǎn)和銷售公司。

ProElut PSA GLASS固相萃取小柱(1 g,6 mL) 迪馬科技有限公司;硅藻土(Diatomite)、C18、石墨化炭黑(GCB)填料 北京振翔科技有限公司;TSQ Quantum GC 三重四級桿氣質聯(lián)用儀、ST-16R型冷凍高速離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 取1.0 g香精于玻璃離心管中,添加適當濃度的內標物,隨后加入0.5 mL正己烷溶液和5 mL乙腈溶液,渦旋超聲30 min,然后以4000 r/min,4 ℃溫度下,離心5 min,收集上層溶液。再加入5 mL乙腈溶液,按上述操作重復提取一次,合并上清液加入玻璃試管中,40 ℃下氮吹至2 mL,待凈化。固相萃取小柱依次加入5 mL二氯甲烷和5 mL乙腈,加入待凈化液,隨后用2 mL乙腈潤洗玻璃試管并加入到萃取柱中,然后加入5 mL乙腈洗脫樣品,收集全部流出液,40 ℃下氮氣吹至近干,加入1 mL正己烷溶解,以備氣相色譜-質譜/質譜分析測定。

1.2.2 氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜條件 色譜條件:色譜柱為DB-17 石英毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為高純氦氣(99.999%),氦氣流速為1.0 mL/min;進樣口溫度為280 ℃;升溫程序:100 ℃為起始溫度,以15 ℃/min升至200 ℃,保持2 min,再以5 ℃/min升至250 ℃,保持2 min,然后以2 ℃/min升至280 ℃,保持2 min。

質譜條件:電子轟擊(EI)離子源,電離能量為70 eV,離子源溫度為250 ℃;GC-MS傳輸線溫度為280 ℃;掃描模式為選擇反應監(jiān)測(SRM)和子離子模式(product);Q2碰撞氣為純度是99.999%的氬氣(1.5 mTorr);燈絲電流為50 μA。

1.2.3 定性、定量方法 以正己烷為溶劑配制濃度范圍在3～1000 μg/L之間的標準溶液,根據(jù)保留時間以及碎片離子定性目標物。本研究采用內標定量,參考溶劑提取率和吸附劑加標回收率,根據(jù)保留時間,DIPrP、DAP和DPrP以D4-DEP為內標,DIPP以D4-BMPP為內標,DHP以D4-DCHP為內標,DIDP以D4-DNOP為內標。

1.3 數(shù)據(jù)處理

平均值、回收率和相對標準偏差的計算采用Microsoft Excel 2007版軟件。

2 結果與分析

2.1 色譜和質譜條件的優(yōu)化

鄰苯二甲酸酯為弱極性化合物,利用DB-17色譜柱(中等極性柱)的分離性能,通過優(yōu)化進樣口、色譜柱程序升溫和傳輸線的溫度,實現(xiàn)有效分離目標化合物(總離子流圖如圖1所示)。而對保留時間相近而不能完全分離的某一些組分,如DAPHE DPrP(保留時間分別為9.58 min和9.62 min),采用SRM技術可以實現(xiàn)未完全分離的鄰苯組分的定性和定量分析。采用三重四級桿質譜檢測時,條件的優(yōu)化一般包括母離子、子離子以及碰撞能量等。

圖1 22種鄰苯二甲酸酯的總離子流圖Fig.1 TIC of 22 phthalate esters

在優(yōu)化SRM參數(shù)時,先通過全掃描方式找出每一組份的保留時間,選取質荷比較大且相對豐度比較高的特征碎片作為母離子。然后將母離子進一步裂解,選取兩個離子作為子離子,同時優(yōu)化碰撞能量,以最佳的子離子響應值進行定性和定量。優(yōu)化后的保留時間、定性定量離子以及碰撞能量信息如表1所示。

表1 22種鄰苯二甲酸酯類和16種內標物的保留時間、定性定量離子和碰撞能量Table 1 Retention time,qualitative and quantitative ion pairs and collision energy of 22 phthalate esters and 16 internal standards

續(xù)表

2.2 線性范圍、方法檢出限和定量限

將鄰苯二甲酸酯混合標準溶液分別配制成質量濃度為3、10、50、100、1000 μg/L的系列標準溶液,分別進行測試,以每種鄰苯二甲酸酯的定量離子峰面積(y)對其質量濃度(x)繪制標準曲線。測定PAEs最低加標水平時的響應,以3倍信噪比(S/N=3)計算方法的檢出限(LOD),以10倍信噪比(S/N=10)確定定量下限(LOQ),結果見表2。

表2 22種鄰苯二甲酸酯的判定系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations,correlation coefficients,LOD and LOQ of 22 phthalate esters

從表2可以看出22種鄰苯二甲酸酯在3.0～1000 μg/L范圍內線性良好(判定系數(shù)R2為0.9922～0.9997),檢出限為0.3～1.0 μg/kg,定量限為1.0～3.0 μg/kg。

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

分別選擇二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷、乙腈和甲醇作為提取溶劑,因很高比例的香精為油溶性物質,當使用二氯甲烷、乙酸乙酯和正己烷為溶劑時,因其具有非極性,會有大量油溶性成分提出,很難進行進一步處理。比較甲醇和乙腈這兩種極性提取溶劑時,發(fā)現(xiàn)甲醇的提取效率明顯弱于乙腈(圖2),因此采用乙腈作為主提取溶劑,同時為了減少油溶性雜質被乙腈提取出,故本試驗采用正己烷作為輔助提取溶劑。

圖2 提取劑對鄰苯二甲酸酯類化合物回收率的影響Fig.2 Effect of extraction solvents on the extraction efficiencies of the phthalate esters

2.4 吸附劑的選擇

香精基質復雜,可能包含色素、脂肪、糖類和蛋白質等雜質從而污染色譜柱和干擾定量。因此需要選取合適的吸附材料來凈化樣品。目前常用吸附劑有硅藻土(Diatomite)、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、C18、石墨化炭黑(GCB)和磁碳納米管等。磁碳納米管因為制作工藝較為復雜[17],并且市面上沒有現(xiàn)成的固相萃取柱可供購買,因此不作為本實驗的研究對象。本實驗研究發(fā)現(xiàn),C18、GCB和硅藻土對于部分鄰苯二甲酸酯回收率偏低,C18對DCHP的回收率為59.1%;硅藻土對BMPP和DHP的回收率分別為59.2%和59.3%;GCB對DIPrP、DPrP、DBP、DHXP、DEHP、DHP和DCHP的回收率均低于60%,而ProElut PSA GLASS固相萃取小柱對于這22種鄰苯二甲酸酯回收率為67.1%～96.1%,滿足實驗需求,因此最終確定采用ProElut PSA GLASS固相萃取小柱。

2.5 方法的回收率和標準偏差

本實驗在空白香精中添加鄰苯混合標準物質進行準確度和精密度試驗。各被測組分分別進行20、40和200 μg/kg 3個加標水平的回收試驗,按1.2.2實驗方法進行前處理,對每個加標水平進行6次平行測定,計算回收率和相對標準偏差,結果如表3所示。從表3可以看出:香精中22種鄰苯二甲酸酯的回收率為82.4%～107.1%,相對標準偏差為≤9.1%,表明該方法的回收率較高,精密度較好。

表3 22種鄰苯二甲酸酯在三個水平下的加回收率和相對標準偏差(n=6)Table 3 The recoveries and RSD of 22 phthalate esters at three levels(n=6)

續(xù)表

2.6 實際樣品分析

采用本文優(yōu)化后的方法,對40批香精樣品進行了測試,在其中18批香精樣品中檢出鄰苯二甲酸酯,檢出率為45.0%,結果如表4所示。所有樣品中,只檢測出3種鄰苯二甲酸酯,分別為DBP,DIBP和DEHP。在18種檢出的樣品中,主要污染物為DBP和DIBP,而DEHP的含量較低或者為未檢出。根據(jù)《衛(wèi)生部辦公廳關于通報食品用香精香料適用鄰苯二甲酸酯類物質最大殘留量有關問題的函》(衛(wèi)辦監(jiān)督函[2011]773號)中的規(guī)定,香精香料的限量標準為60 mg/kg。因此這18個樣品均未達到限量標準,并不構成嚴重的塑化劑污染風險,但是香精作為食品添加劑,普遍添加于各種食品中,而塑化劑被稱為環(huán)境激素,對人體健康產(chǎn)生不利影響,特別是幼兒以及兒童,因此香精中鄰苯二甲酸酯較高的檢出率,應受到足夠的關注。

表4 香精中22種鄰苯二甲酸酯的檢測結果Table 4 The results of 22 phthalate esters

3 結論

本研究建立了氣相色譜-三重四級桿串聯(lián)質譜同時測定香精中22種鄰苯二甲酸酯,采用內標法定量。該方法擁有良好的樣品凈化效果且前處理方法簡單,精密度、準確度均能滿足日常檢測需求,適合大批量檢測香精中的22種鄰苯二甲酸酯。由于本方法采用了串聯(lián)三重四級桿質譜,有較高的選擇性和靈敏度,可以有效的避免假陽性的產(chǎn)生。在實際樣品檢測中發(fā)現(xiàn),雖然鄰苯二甲酸酯含量不高,低于衛(wèi)辦監(jiān)督函[2011]773號中的規(guī)定,但是檢出率較高(45.0%),由于鄰苯二甲酸酯的生物危害性,所以應該得到足夠的關注。