甲狀腺乳頭狀癌組織中CELF1表達(dá)及其功能研究

金沅武，趙 媛

(山東省淄博礦業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司中心醫(yī)院 腫瘤血液科，山東 淄博 255120)

乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)是最為主要的甲狀腺癌病理學(xué)類型，約占90%以上，具有多灶性生長(zhǎng)及局部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，是導(dǎo)致部分患者復(fù)發(fā)及預(yù)后不佳的主要因素[1]。CELF1也稱為CUG連接蛋白1(CUG-binding protein 1，CUGBP1)，是RNA連接蛋白CELF家族重要成員之一，在調(diào)控mRNA翻譯、降解過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[2]，近年來研究發(fā)現(xiàn)其與惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展關(guān)系密切，與非小細(xì)胞肺癌患者不良預(yù)后有關(guān)[3]，參與了膀胱癌BIU-87細(xì)胞增殖和侵襲過程[4]。本研究擬分析PTC組織中CELF1表達(dá)，并探討其對(duì)PTC細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年3月～2016年12月在我院擇期行根治性手術(shù)治療的PTC患者78例，納入標(biāo)準(zhǔn)：①首發(fā)初次手術(shù)；②術(shù)前未接受任何治療；③術(shù)后病理檢查確診為PTC。男29例，女49例，年齡30～65歲，平均年齡(47.8±10.4)歲。將手術(shù)中獲得的PTC組織及癌旁組織用甲醛固定，石蠟包埋保存。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者或家屬均知情同意。

1.2 主要試劑和設(shè)備 免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物，兔抗人CELF1多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam，人PTC細(xì)胞株TPC-1購(gòu)自上海拜力生物科技公司，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Lipofectamin 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、總RNA提取試劑盒(Trizol法)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，CELF1干擾序列及對(duì)照序列均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成，CELF1和內(nèi)參引物由上海生工生物公司設(shè)計(jì)合成，CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海拓然生物科技公司，Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABJ公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組化法檢測(cè)PTC組織和癌旁組織中CELF1蛋白表達(dá) 取石蠟包埋組織，切片、脫水，浸入檸檬酸鹽中高壓抗原修復(fù)，用3%過氧化氫封閉。加入一抗兔抗人CUGBP1多克隆抗體(1∶800稀釋)，4℃過夜孵育，次日復(fù)溫1 h，PBS沖洗3次，加入通用型二抗，室溫下孵育60 min，PBS沖洗3次，二胺基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。PBS代替一抗作為對(duì)照，光學(xué)顯微鏡觀察。結(jié)果判定：高倍鏡下隨機(jī)取10個(gè)視野，按照半定量法對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定[5]，①染色強(qiáng)度：0分無色；1分淡黃色；2分棕黃色；3分黃褐色；②陽性細(xì)胞比例：0分≤5%；1分6%～25%；2分26%～50%；3分51%～75%；4分>75%；③將兩項(xiàng)評(píng)分相乘，≤1分為陰性(-)，>1分為陽性(+)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)對(duì)TPC-1細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：5% CO2、飽和濕度、37℃恒溫培養(yǎng)箱。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化，傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)進(jìn)行分組轉(zhuǎn)染，①CELF1干擾序列組，轉(zhuǎn)染CELF1基因的干擾序列：5′-GAGCCAACCUGUUCAUCUA-3′；②對(duì)照序列組，轉(zhuǎn)染干擾序列的對(duì)照序列：5′-AAAGGACGGAGGACATTAT-3′；③空白組，不作任何處理。各組轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)，完成后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中CELF1表達(dá) 轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h時(shí)，取各組細(xì)胞，用Trizol試劑對(duì)總RNA提取，并分析總RNA濃度，以A260/A280 1.80～2.10為合格，將合格樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，保存于-20℃?zhèn)溆?。按照PCR試劑盒說明進(jìn)行引物擴(kuò)增，引物序列，CELF1，上游：5′-GCUUUGGUUUUGUAAGUUA-3′；下游：5′-GGCUUAAAGUGCAGCUCAA-3′；GAPDH，上游：5′-TGATGGTACATGACAAGGTGC-3′，下游：5′-ACAGTCCATGCCATCACTGC-3′。PCR條件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，70℃ 30 s，連續(xù)循環(huán)擴(kuò)增38次，利用2-△△Ct獲得各組細(xì)胞中CELF1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.3.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取各組轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h細(xì)胞，接種至96孔板，調(diào)整密度為2×103個(gè)/孔，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，置于恒溫培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)4 h。待細(xì)胞貼壁后，于培養(yǎng)12、24、48、72、96 h時(shí)，分別將CCK-8液10 μL加入各孔，恒溫孵育培養(yǎng)3 h。用酶標(biāo)儀取450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A值。

1.3.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取各組轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，取約500個(gè)細(xì)胞接種在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)14 d至肉眼見到有克隆形成止。除去培養(yǎng)液，加入4%多聚甲醛，固定25 min，PBS沖洗3次，結(jié)晶紫染色25 min，用低倍顯微鏡觀察，以超過50個(gè)細(xì)胞為1個(gè)克隆數(shù)，計(jì)算克隆形成率(%)=克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.3.6 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 將Matrigel基質(zhì)膠稀釋后平鋪于Transwell小室，37℃風(fēng)干后使用。將培養(yǎng)48 h細(xì)胞消化后，制備細(xì)胞懸液，取約2×105個(gè)細(xì)胞加入到小室上室，將含有20%胎牛血清的培養(yǎng)液約500 μL加入小室，放在恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h。將小室取出，除去培養(yǎng)液，PBS沖洗2次，4%甲醛固定，用棉簽將未穿膜的散落細(xì)胞去除，0.1%結(jié)晶紫染色25 min，用倒置顯微鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 PTC組織和癌旁組織中CELF1蛋白表達(dá) PTC組織中CELF1蛋白陽性表達(dá)率(75.64%)高于癌旁組織(38.46%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=22.002，P=0.000)，見圖1。

2.2 PTC組織中CELF1蛋白表達(dá)與臨床病理特征相關(guān)性 PTC組織中CELF1蛋白表達(dá)與TNM分期、侵犯被膜和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見表1。

A.PTC組織；B.癌旁組織，定位于細(xì)胞質(zhì)，圖片標(biāo)尺為50 μm。

圖1 PTC組織和癌旁組織中CELF1蛋白表達(dá)

表1 PTC組織中CELF1蛋白表達(dá)與臨床病理特征的相關(guān)性[n(%)]

指標(biāo)nCELF1蛋白表達(dá)+-χ2P年齡/歲 ≥454836(75.00)12(25.00) <453020(66.67)10(33.33)0.6330.426性別 男2921(72.41)8(27.59) 女4935(71.43)14(28.57)0.0090.926腫瘤直徑/cm >21814(77.78)4(22.22) ≤26042(70.00)18(30.00)0.4140.520腫瘤數(shù)量 單個(gè)5843(74.14)15(25.86) 多個(gè)2013(65.00)7(35.00)0.6130.434TNM分期 Ⅰ^Ⅱ期5535(63.64)20(36.36) Ⅲ^Ⅳ期2321(91.30)2(8.70)6.1310.013侵犯被膜 是2119(90.48)2(9.52) 否5737(64.91)20(35.09)4.9530.026淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 是4339(90.70)4(9.30) 否3517(48.57)18(51.43)16.9090.000

2.3 各組細(xì)胞中CELF1基因表達(dá)、細(xì)胞克隆形成率和細(xì)胞侵襲能力 與對(duì)照序列組和空白組相比，CELF1干擾序列組細(xì)胞中CELF1 mRNA相對(duì)表達(dá)量降低(P<0.05)，見表2；與對(duì)照序列組和空白組比較，CELF1干擾序列組細(xì)胞克隆形成率降低(P<0.05)，見表2、圖2。與對(duì)照序列組和空白組比較，CELF1干擾序列組侵襲細(xì)胞數(shù)降低(P<0.05)，見表2、圖3。

組別CELF1 mRNA相對(duì)表達(dá)量細(xì)胞克隆形成率/%侵襲細(xì)胞數(shù)/個(gè)空白組2.17±0.1475.24±3.53124.96±8.04對(duì)照序列組2.20±0.0778.49±5.95122.36±6.07CELF1干擾序列組1.11±0.13ab20.78±4.23ab82.98±8.76abF163.436287.53755.867P0.0000.0000.000

注：與空白組比較，aP<0.05；與對(duì)照序列組比較，bP<0.05。

A.空白組；B.對(duì)照序列組；C.CELF1干擾序列組。

圖2 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

A.空白組；B.對(duì)照序列組；C.CELF1干擾序列組。

圖3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

2.4 各組細(xì)胞增殖能力 與空白組和對(duì)照序列組比較 CELF1干擾序列組細(xì)胞24、48、72、96 h時(shí)吸光度A值均降低(P<0.05)，見表3、4。

組別12 h24 h48 h72 h96 h空白組0.17±0.020.39±0.030.54±0.070.65±0.100.75±0.02對(duì)照序列組0.17±0.060.38±0.030.50±0.120.71±0.200.81±0.10CELF1干擾序列組0.14±0.020.25±0.08ab0.29±0.12ab0.38±0.07ab0.51±0.09ab

注：與空白組比較，aP<0.05；與對(duì)照序列組比較，bP<0.05。

表4 各組細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)吸光度A值重復(fù)測(cè)量方差分析

變異來源DfSSMSF P 分組20.7670.38461.0780.000檢測(cè)時(shí)間2.1873.0681.40387.8260.000分組×?xí)r間4.3740.2290.0523.2770.020

注：Mauchly球形檢驗(yàn)W=0.134，P=0.002，拒絕球形假設(shè)，需校正。

3 討論

由于PTC發(fā)病隱匿，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)可能已經(jīng)存在頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處侵犯[6]，盡管PTC患者5年生存率達(dá)95%以上，但仍有部分患者由于腫瘤細(xì)胞侵襲力強(qiáng)、細(xì)胞分化程度低而預(yù)后不佳[7]。CELF1基因位于人染色體11p11上，最初發(fā)現(xiàn)在強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良發(fā)生中發(fā)揮重要作用[8]，隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)其在惡性腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用，在肺癌[9]、口腔鱗癌[10]、膠質(zhì)瘤[11]等多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，且與細(xì)胞增殖及侵襲力密切相關(guān)，亦有研究表明[12]，CELF1高表達(dá)可作為預(yù)后不良的標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示，CELF1蛋白在PTC組織中呈高表達(dá)，可能參與了PTC發(fā)生過程，且與PTC進(jìn)展及惡性轉(zhuǎn)移過程有關(guān)。

特異性干擾PTC細(xì)胞中CELF1基因后，CELF1干擾序列組細(xì)胞中CELF1基因表達(dá)被成功抑制。有研究指出[13]，CELF1高表達(dá)可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期改變。本研究結(jié)果顯示，CELF1干擾序列組細(xì)胞24、48、72、96 h時(shí)吸光度A值均低于對(duì)照序列組和空白組，且克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，CELF1干擾序列組細(xì)胞克隆形成率較對(duì)照序列組和空白組降低，這些結(jié)果說明沉默PTC細(xì)胞中CELF1基因可減少細(xì)胞增殖能力，提示CELF1基因高表達(dá)可能參了PTC細(xì)胞惡性增殖過程。本研究結(jié)果顯示，CELF1干擾序列組侵襲細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照序列組和空白組，說明CELF1基因參與了PTC細(xì)胞侵襲過程，與細(xì)胞侵襲力相關(guān)。

綜上所述，CELF1蛋白在PTC組織中呈高表達(dá)，特異性下調(diào)PTC細(xì)胞中CELF1基因表達(dá)可減少細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞侵襲力，有望為PTC臨床防治提供新的基因靶位。