黑果枸杞花色苷對(duì)部分睡眠剝奪大鼠心肌損傷的保護(hù)作用

溫朝玲，劉春紅，孫雯雯，汪 洋

(1．安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 護(hù)理系，安徽 蕪湖 241000；2.蕪湖市第二人民醫(yī)院 骨外科，安徽 蕪湖 241000；3．蕪湖市第二人民醫(yī)院 病理科，安徽 蕪湖 241000；4．安徽中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校 醫(yī)療系，安徽 蕪湖 241000)

黑果枸杞是我國西部特有的藥食兩用植物，其代表性的營(yíng)養(yǎng)成分花色苷是從黑果枸杞成熟果實(shí)中提取的一種紫紅色水溶性色素，屬于天然類黃酮類多酚化合物[1]，具有抗氧化、預(yù)防心腦血管疾病、增強(qiáng)非特異性免疫和改善記憶力等多種生理活性功能[2]。

部分睡眠剝奪(partial sleep deprivation,PSD)可引起心肌炎、心臟擴(kuò)大、冠心病等[3]。但是目前關(guān)于黑果枸杞花色苷對(duì)PSD大鼠心肌損傷的保護(hù)研究報(bào)道甚少。故本研究通過制備改良多平臺(tái)PSD大鼠模型，研究黑果枸杞花色苷對(duì)PSD模型大鼠心肌損傷標(biāo)志物含量、抗氧化標(biāo)志物含量相關(guān)指標(biāo)以及心肌組織病理學(xué)改變來探究黑果枸杞花色苷對(duì)PSD大鼠心肌損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 SD大鼠68只，體質(zhì)量180～220 g，購自南京青龍山動(dòng)物中心[許可證號(hào)：SCXK(蘇)2017-0001]。實(shí)驗(yàn)過程中室內(nèi)溫度控制在(24±1) ℃，部分睡眠剝奪時(shí)間為中午2時(shí) 至次日上午8時(shí)。

1.2 藥物 復(fù)方丹參片(國藥準(zhǔn)字:G17A011)；黑果枸杞花色苷。黑果枸杞花色苷的制備：黑果枸杞花色苷由本校中藥實(shí)驗(yàn)室自行制備。黑果枸杞購自亳州藥材市場(chǎng)，取黑果枸杞成熟果實(shí)200 g，粉碎，提取其花色苷用15倍量pH 4的70%乙醇浸提2 h，提取溫度為60℃[6]?；亓魈崛?次，水提物經(jīng)旋蒸濃縮后，吸附，干燥后的暗紫色粉末即為黑果枸杞花色苷類提取物。運(yùn)用pH示差法測(cè)定黑果枸杞提取物中花色苷的含量為57%[4-6]。

1.3 試劑 CK-MB、cTnI測(cè)試盒均購于貝克曼庫爾特實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(蘇州)有限公司(批號(hào)分別為GC8198、EA8168)。T-AOC、SOD、MDA測(cè)試盒購于南京建成生物工程研究所(批號(hào)分別為20180111、20180110、20180109)。

1.4 儀器 BX43普通光學(xué)顯微鏡及顯微照相機(jī)(Olympus公司)，組織勻漿機(jī)(德國IKA T10)；Anthos Zenyth 200 酶標(biāo)儀(安圖生物)；RE-5298A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(西安禾普生物科技有限公司)；1-14K臺(tái)式冷凍離心機(jī)(德國Sigma公司)；貝克曼庫爾特AU5800全自動(dòng)血細(xì)胞生化分析儀。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 動(dòng)物分組及給藥 60只SD大鼠隨機(jī)分為：正常對(duì)照組(N組)、PSD模型組(M組)、復(fù)方丹參片對(duì)照組(CDT組)、PSD+黑果枸杞花色苷低劑量組(LrM-L組)，PSD+黑果枸杞花色苷中劑量組(LrM-M組)，PSD+黑果枸杞花色苷高劑量組(LrM-H組)6組，每組10只。6組大鼠均每天灌胃1次，LrM-L、LrM-M、LrM-H分別灌服黑果枸杞花色苷0.25、0.5、1.5 g/(L·kg·d)；正常對(duì)照組(給予等體積的0.9%NaCl)、PSD模型組(給予等體積的0.9%NaCl)、復(fù)方丹參片對(duì)照組[復(fù)方丹參片0.32 g/(L·kg·d)]。PSD 4組大鼠均每天睡眠剝奪18 h，共持續(xù)21 d。

1.5.2 大鼠PSD模型建立 采用改良多平臺(tái)大鼠睡眠剝奪法建立大鼠PSD 模型[7-8]，大鼠睡眠剝奪箱設(shè)計(jì)成長(zhǎng)方體(105 cm ×60 cm ×65 cm 的有機(jī)玻璃做成)，箱內(nèi)設(shè)置15個(gè)直徑6.5 cm,高10.0 cm的小平臺(tái),小平臺(tái)之間間隔為15 cm。每天實(shí)驗(yàn)開始前2 h開始加水，水深約8.5 cm。上面罩有4目的鐵絲網(wǎng)。

1.6 血清指標(biāo)檢測(cè) 以2.2 mL/kg烏拉坦腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取全血約5 mL并離心(1200 r/min，10 min，4℃)后取血清，按試劑盒采用ELISA法測(cè)定血清cTnI、CK-MB 、T-AOC水平。

1.7 心肌組織勻漿制備及SOD、MDA 等指標(biāo) 取麻醉后大鼠的左心室前壁心肌組織約0.3～0.4 g，用冰的生理鹽水洗滌數(shù)次。剪碎心肌組織，加入冷的生理鹽水2.7～3.6 mL，用IKA T10勻漿器得到10%心肌組織勻漿液。離心(3000 r/min，10 min)后取上清液分裝-20℃凍存?zhèn)溆?，待測(cè)SOD、MDA。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 12．0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩采用q檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PSD大鼠一般情況觀察 在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，前3天有4例大鼠死亡。實(shí)驗(yàn)早期，PSD大鼠表現(xiàn)出一定的交感神經(jīng)亢奮的行為，如活動(dòng)量增多，體質(zhì)量減少，少數(shù)PSD大鼠在小平臺(tái)間不停地跳動(dòng)，進(jìn)食量增大，對(duì)聲光的刺激較為敏感。隨著睡眠剝奪時(shí)間的延長(zhǎng)，PSD大鼠則表現(xiàn)為異常地狂躁，進(jìn)食及飲水量均明顯減少，攻擊性強(qiáng)[9]。但是LrM-L、LrM-M、LrM-H組、CDT組大鼠的交感神經(jīng)亢奮的行為較PSD大鼠有改善，LrM-H組除體質(zhì)量減少行為無明顯變化。

2.2 黑果枸杞花色苷對(duì)PSD大鼠血清中心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、cTnI及T-AOC含量的影響 與正常組相比，PSD模型組大鼠的CK-MB和cTnI含量升高(P<0.01)但血清T-AOC活力下降(P<0.01)；與PSD模型組相比，CDT對(duì)照組的CK-MB和cTnI下降(P<0.05)，LrM-H和LrM-M組的CK-MB和cTnI含量下降(P<0.01、P<0.05)。說明黑果枸杞花色苷的高劑量能改善PSD所致的大鼠血清中心肌損傷標(biāo)志性酶的異常升高。

與正常組相比，PSD模型組血清T-AOC活力下降(P<0.01)；與PSD模型組相比，黑果枸杞花色苷(LrM-L、LrM-M、LrM-H)組、CDT對(duì)照組升高(P<0.05)。LrM-H和LrM-M組的T-AOC含量升高(P<0.01、P<0.05)；LrM-L組和CDT組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 黑果枸杞花色苷對(duì)大鼠血清心肌損傷標(biāo)志物CK-MB、cTnI、及T-AOC含量的影響

組別CK-MB/(U/L)cTnI/(μg/L)T-AOC/(U/L)N組650.33±57.831.05±0.199.87±3.0M組1717.35±287.40▲1.88±0.22▲6.50±2.3▲CDT組910.75±183.56◆◆1.42±0.18◆7.18±1.8◆LrM-L組1253.62±147.38◆◆1.50±0.23◆7.12±1.2◆LrM-M組1087.5±148.36◆◆1.40±0.20◆7.81±1.4◆◆LrM-H組874.45±163.75◆◆1.28±0.17◆◆8.91±1.5◆◆F36.9314.564.27P0.0000.0000.002

注：與正常組比較，▲P<0.01,與模型組比較，◆◆P<0.01,◆P<0.05。

2.3 黑果枸杞花色苷對(duì)PSD大鼠心肌SOD及MDA活性的影響 與正常組比較，PSD組的心肌SOD含量降低(P<0.05)；與PSD組對(duì)比，CDT對(duì)照組(P<0.05)、黑果枸杞花色苷各組升高(LrM-L組P<0.05，LrM-M組P<0.05，LrM-H組P<0.01),且LrM-H組(P<0.01)、LrM-M組(P<0.05)高于LrM-L組、LrM-L、LrM-M、LrM-H組血清SOD的活性隨劑量的增加而遞增。

與正常組比較，PSD組MDA含量升高(P<0.05)，與PSD組對(duì)比，CDT對(duì)照組(P<0.05)、黑果枸杞花色苷各組的心肌MDA降低(LrM-L組P<0.05，LrM-M組P<0.05，LrM-H組P<0.01),且LrM-H組(P<0.01)、LrM-M組(P<0.05)低于LrM-L組，LrM-L、LrM-M、LrM-H組血清MDA的活性隨劑量的增加而遞減。LrM-H組心肌SOD活性MDA含量要優(yōu)于CDT組。見表2。

2.4 各組大鼠心肌組織病理學(xué)比較PSD模型組大鼠的心肌細(xì)胞排列松散，見心肌纖維化程度不一、細(xì)胞水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；和模型組相比，黑果枸杞花色苷各劑量組PSD大鼠心肌病理性改變有由重到輕的演變，以黑果枸杞花色苷高劑量組改善尤為顯著。說明黑果枸杞高劑量組和復(fù)方丹參片組均可減輕心室重構(gòu)，改善睡眠剝奪所造成的心肌細(xì)胞纖維化，對(duì)心肌細(xì)胞的損傷有保護(hù)作用。見圖1。

表2 黑果枸杞花色苷對(duì)大鼠心肌SOD及MDA含量的影響

組別SOD/(U/mgprot)MDA/(nmol/mgprot)N組238.5±11.302.19±0.14M組142.23±8.35▲4.24±0.17▲CDT組179.5±13.21◆1.69±0.11◆◆LrM-L組175.53±9.25◆1.50±0.16◆LrM-M組189.46±8.28◆◆1.62±0.14◆◆LrM-H組204.17±11.91◆◆1.82±0.15◆◆F136.08526.13P0.0000.000

注：與正常組比較，▲P<0.01,與模型組比較，◆◆P<0.01,◆P<0.05。

A．N組；B.M組；C.LrM-L組；D.LrM-M組；E.LrM-H組；F.CDT組。

圖1 各組大鼠心肌病理學(xué)改變(HE，×400)

3 討論

人類生命的1/3時(shí)間是在睡眠中度過的。在我國約45.4%的人存在不同程度的睡眠剝奪問題[10]。晝夜節(jié)律是普遍存在于生物界的一種生理現(xiàn)象[11-12]。Everson等[13]研究表明,睡眠剝奪是一種氧化應(yīng)激模型，影響了機(jī)體的晝夜節(jié)律并通過多靶點(diǎn)、多路徑誘發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)。PSD作為強(qiáng)烈的應(yīng)激源，在高水平兒茶酚胺和糖皮質(zhì)激素作用下,機(jī)體自由基產(chǎn)生和清除失衡,引發(fā)廣泛的損傷效應(yīng)，引起心血管炎癥反應(yīng)[3]。PSD降低心肌細(xì)胞抗氧化酶(SOD、CAT)的活性，伴有心肌細(xì)胞損傷標(biāo)志物(CK-MB、cTnI)過度表達(dá)；T-AOC水平能夠反映機(jī)體整體抗氧化能力[14]，MDA含量水平能夠直接反映機(jī)體過氧化損傷程度[15]。

本研究采用PSD大鼠來模擬成人的睡眠障礙，通過觀察各組大鼠一般情況，檢測(cè)血清和心肌組織中氧化及抗氧化指標(biāo)，分析心肌病理學(xué)變化來探討黑果枸杞花色苷對(duì)PSD大鼠心肌損傷的保護(hù)作用。從以上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知黑果枸杞花色苷對(duì)PSD大鼠心肌損傷具有保護(hù)作用，呈劑量依賴性。LrM-H組消減氧化自由基的能力優(yōu)于CDT組，未發(fā)現(xiàn)重要臟器的損害現(xiàn)象。其機(jī)制可能與黑果枸杞中的花色苷成分在部分睡眠剝奪過程中穩(wěn)定心肌細(xì)胞的細(xì)胞膜，延緩或抑制心肌細(xì)胞在急性應(yīng)激損害的過程中釋放炎性介質(zhì)物所引發(fā)的心肌損害，穩(wěn)定機(jī)體睡眠剝奪所引起的氧化應(yīng)激、降低自由基水平有關(guān)，其確切機(jī)制有待進(jìn)一步研究。