MiR-199b-5p過表達在腎小球足細胞中的作用及基因表達特征

龔向前，魚敏逸，陳俊宇，顧欣雨，李善文，張愛青，甘衛(wèi)華

(南京醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院 兒科，江蘇 南京 210003)

足細胞是一種高度分化的上皮細胞，在保持腎小球濾過屏障的完整性中起重要作用，防止蛋白尿的發(fā)生。足細胞易受到各種損傷，且增殖能力較差，損傷后很難再生[1]，足細胞損傷后導致腎小球濾過屏障減弱，引起蛋白尿的發(fā)生[2]。蛋白尿是導致腎功能損傷的危險因素，因足細胞損傷引起的腎臟方面疾病是全球性問題。microRNAs是一大類小型非編碼RNA，可以誘導靶基因的轉錄后沉默，調(diào)控眾多的生物學過程，在細胞發(fā)育及凋亡中均發(fā)揮重要作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，microRNAs(miRNAs)是維持足細胞體內(nèi)平衡所必需的，在腎臟的病理和生理過程中有重要的調(diào)控作用，miRNAs的缺失會引起足細胞損傷，導致蛋白尿的產(chǎn)生[4]。前期研究中發(fā)現(xiàn)miR-199b-5p在正常小鼠和阿霉素腎病小鼠中差異表達，miR-199b-5p保守性相對較高，在多個物種中都有表達(表1)。本研究通過高通量測序了解足細胞過表達miR-199b-5p后基因表達變化及在足細胞凋亡中的作用，旨在為臨床治療腎臟疾病提供新的理論依據(jù)及治療手段。

表1 不同物種miR-199b-5p成熟序列

序列號物種堿基序列MIMAT0000263hsa-miR-199b-5pcccaguguuuagacuaucuguucMIMAT0000672mmu-miR-199b-5pcccaguguuuagacuaccuguucMIMAT0013780eca-miR-199b-5pcccaguguuuagacuaucuguucMIMAT0017339 ssc-miR-199b-5pcccaguguuuagacuaucuguu

1 材料與方法

1.1 實驗材料 正常小鼠足細胞(Mundel教授惠贈:Albert Einstein college of Medicine)；胰蛋白酶、1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)；干擾素-γ(英國pepro Tech公司)；lipofectamine 2000、miR-199b-5p mimics、miRNA NC(上海吉瑪公司)；qRT-PCR 試劑盒(銳博公司)；凋亡試劑盒(BD公司)；Trizol試劑盒(美國invitrogen公司)；PCR儀、FACSVerse流式細胞儀(法國BD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 永生化小鼠足細胞在添加10%胎牛血清、10 μL/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素、10 U/ mL重組小鼠干擾素-γ的RPMI 1640培養(yǎng)基中，含有5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中33℃促進生殖傳代，在細胞生長至約80%融合時，用0.25%胰酶消化傳代。傳代2次后在37℃不含干擾素-γ培養(yǎng)基中誘導細胞分化成熟，待培育12d 分化成熟后用于實驗。

1.2.2 細胞轉染 小鼠足細胞按每104/孔左右接種在6孔板中，當細胞生長至70%～80%融合時棄去培養(yǎng)液進行瞬時轉染。將6孔板分為空載對照(NC)組和過表達質(zhì)粒組(mimics組)，每孔使用200 μL無血清培養(yǎng)基分別稀釋5.0 μL miRNA NC、miR-199b-5p mimics，同時取6 μL lipofectamine 2000稀釋到200 μL無血清培養(yǎng)基中，兩者在5 min內(nèi)混勻，室溫放置20 min后加入不含血清的2 mL培養(yǎng)液中，6 h后更換成新鮮無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h誘導足細胞損傷。

1.2.3 RNA提取及qRT-PCR 細胞轉染48 h后，按Trizol試劑盒說明書操作，每孔加0.5 mL Trizol提取NC組和mimics組細胞的總RNA。使用紫外分光光度計測定A260/A280處RNA吸收峰，并對總RNA進行定量。按照qRT-PCR試劑盒，反應總體系為10 μL，將得到的RNA逆轉錄為cDNA。實時熒光定量PCR選用20 μL反應體系，每個體系含10 μL SYBR Green，2 μL模板cDNA，上下游引物各0.8 μL；反應條件如下：預變性(95℃，10 min)、變性(95℃，10 s)、退火(60℃，20 s)、延伸(70℃，10 s)40個循環(huán)。以內(nèi)源性U6作為對照基因使數(shù)據(jù)標準化，每組重復3次，按照2-(ΔΔCt)法，計算目的基因相對表達量。

1.2.4 流式Annexin V-PE/7-AAD檢測足細胞凋亡 足細胞在無血清培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h誘導足細胞損傷，每組重復3次，用不含EDTA 胰酶消化后收集足細胞，用4℃磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞并離心，加入Bling Buffer重懸足細胞，各加入5 μL Annexin V-PE和7-AAD，室溫環(huán)境中避光孵育20 min，使用流式細胞儀在586/42nm AV-PE和527/32 nm 7-AAD條件下進行細胞凋亡分析并定量,凋亡細胞通過早期凋亡和晚期凋亡總和(LR+UR)表示。

1.2.5 RNA高通量測序 提取的總RNA樣品送至上?？党晒荆?jīng)瓊脂糖電泳及Nanodrop質(zhì)檢和定量后，用oligo(dT)磁珠富集mRNA；RNA測序文庫由試劑盒完成，用 Agilent 2100對RNA文庫進行質(zhì)檢，并由qPCR方法進行文庫定量，使用 Illumina Hiseq 4000 測序儀進行測序。

1.3 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)應用SPSS 17.0 軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差表示，組間數(shù)據(jù)采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 轉染miR-199b-5p mimics后足細胞中miR-199b-5p的表達 細胞轉染48 h后使用qRT-PCR檢測足細胞中miR-199b-5p表達水平結果顯示，與NC組(1.00±0.08)相比，轉染miR-199b-5p mimics足細胞中miR-199b-5p的相對表達水平(12.17±0.31)較NC組升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=71.084，P<0.05)(圖1)。

NC：空載對照組；mimics：過表達組；*P<0.05vsNC組。

圖1 足細胞中miR-199b-5p的相對表達水平

2.2 過表達miR-199b-5p對足細胞凋亡的影響 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)足細胞48 h誘導足細胞損傷，流式細胞儀檢測足細胞凋亡結果顯示(紅色框內(nèi))：對照組足細胞凋亡率為(32.97±1.45)%，過表達mimics組為(25.51±0.94)%，與NC組相比，過表達miR-199b-5p可以抑制足細胞凋亡，差異有統(tǒng)計學意義(t=8.521，P<0.05)，見圖2。

2.3 基因表達譜變化 高通量測序基因表達譜顯示，過表達 miR-199b-5p足細胞中較NC組的基因差異表達，紅色表示上調(diào)基因，綠色表示下調(diào)基因(圖3A)；與NC組相比，過表達 miR-199b-5p后，有11 114個基因表達發(fā)生變化，其中106個基因下調(diào)大于1.5倍，99個基因上調(diào)大于1.5倍(圖3B)。

2.4 基因功能富集分析 對下調(diào)大于1.5倍的基因進行基因功能(GO)和信號通路(Pathway)富集分析來鑒定這些差異表達基因功能，采用DAVID數(shù)據(jù)庫的GO方法工具了解差異基因的生物學過程和途徑。根據(jù)分析結果顯示，這些基因豐富了轉錄的生物學過程，參與了NF-κB和TNF信號通路的調(diào)控、肌動蛋白骨架構成、細胞周期、凋亡、自噬等多方面(圖4)。

NC：空載對照組；mimics：過表達組；*P<0.05vsNC組。

圖2 過表達 miR-199b-5p對足細胞凋亡的影響

NC：空載對照組；mimics：過表達組。

圖3 過表達mimics組和對照組NC基因表達變化

A.生物過程；B.細胞組成；C.分子功能；D.信號通路。

圖4 下調(diào)基因功能富集分析

3 討論

足細胞損傷是多種腎臟疾病共有的病理生理變化，廣泛存在于微小病變性腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化、IgA腎病等腎臟疾病中[5]，遺傳、機械、免疫應激以及毒素在內(nèi)的許多因素都可引起足細胞損傷[6]，足細胞長期持續(xù)損傷會引起腎小球的減少，最終導致腎臟功能的喪失。

近年來miR-199b-5p被廣泛研究，其在紅細胞產(chǎn)生[7]，髓母細胞瘤[8]中都有重要調(diào)節(jié)作用。在本研究中，過表達miR-199b-5p可提高足細胞存活力，減少足細胞凋亡，這一研究結果初步提示miR-199b-5p過表達在足細胞凋亡中的保護作用。為進一步闡述miR-199b-5p保護足細胞的分子機制，通過高通量測序檢測miR-199b-5p mimics組和NC組足細胞中基因表達譜變化。結果顯示，與NC組比較有11 114個差異表達基因，其中106個基因下調(diào)大于1.5倍，考慮到miRNAs主要通過抑制靶基因的表達發(fā)揮其生物學功能，因此主要針對下調(diào)的基因進行功能富集分析，結果發(fā)現(xiàn)，這些潛在靶基因可能通過NF-κB和TNF信號通路、調(diào)控肌動蛋白骨架穩(wěn)定性、細胞周期、凋亡等多個方面參與對足細胞凋亡的保護作用。

通過 TargetScan和miRDB數(shù)據(jù)庫預測miR-199b-5p的靶基因，結合高通量測序結果中下調(diào)的差異基因，發(fā)現(xiàn)miR-199b-5p可能通過不同的靶基因在細胞凋亡過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用：①UBL3是一種泛素樣蛋白，Verma等[9]在細胞黏附、細胞骨架組織的通路中發(fā)現(xiàn)UBL3基因的改變。肌動蛋白細胞骨架的穩(wěn)定對維持正常足細胞結構起著至關重要的作用，肌動蛋白細胞骨架的重排是蛋白尿發(fā)生的關鍵，導致腎臟疾病進行性加重[10]。②靶基因脂肪細胞質(zhì)膜相關蛋白(APMAP)在脂肪細胞分化中發(fā)揮重要作用[11]，另外，APMAP在NF-κB信號通路中也有重要調(diào)控作用，下調(diào)APMAP可以促進NF-κB信號通路的激活[12]，NF-κB信號通路的激活可降低TNF誘導的細胞凋亡，而在NF-κB活性缺乏的情況下，TNF誘導的細胞凋亡的敏感性將顯著增加[13]。③G蛋白信號傳導(RGS)蛋白超家族具有巨大的結構和功能多樣性，與細胞功能及疾病發(fā)生有著密切相關性[14]。RGS10是RGS家族中較小的一個，在多個組織中都有表達，研究發(fā)現(xiàn)，敲低RGS10可以促進腫瘤細胞的生長、存活，減少細胞凋亡[15]，提示了下調(diào)RGS10在細胞凋亡中的保護作用。同時，Altman等[16]發(fā)現(xiàn)，抑制RGS10可以誘導mTOR信號通路的激活，激活的mTOR可以通過Akt途徑提高細胞存活率，減少細胞凋亡。

綜上表明，過表達miR-199b-5p可能在足細胞損傷中發(fā)揮重要保護作用，通過對靶基因表達的調(diào)控，影響NF-κB、TNF、mTOR等信號通路，調(diào)控肌動蛋白骨架穩(wěn)定等多個方面抑制足細胞的凋亡。目前還尚未報道m(xù)iR-199b-5p與足細胞損傷相關方面的研究，而本研究可以幫助闡明miR-199b-5p在腎臟足細胞損傷中的調(diào)控作用，提供新的研究方向，盡可能地為各種因足細胞損傷引起的腎臟疾病提供干預方案。