大鼠尾椎髓核干細胞的分離與分化能力

沈 陽，徐宏光，張 嶼，王 效，肖 良，劉 晨，金中行

(皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 脊柱外科，安徽 蕪湖 241001)

下腰痛與椎間盤退變密切相關，在人群中普遍存在。研究表明，超過半數(shù)以上的腰部疼痛是由椎間盤退變導致的[1-2]。目前，對于椎間盤退變的治療仍然以內(nèi)科治療為主，其遠期療效并不理想，而對于外科治療，雖然能快速解決椎間盤退變帶來的癥狀，但是并不能延緩椎間盤退變的病變進程。除此之外，椎間盤由位于中央?yún)^(qū)域的髓核、外圍的纖維環(huán)以及上下側的軟骨終板共同組成,作為人體內(nèi)最大的無脈管結構，細胞主要通過擴散作用汲取鄰近椎體血管內(nèi)的氧氣及營養(yǎng)物質(zhì)，因此來自血液及骨髓的外源性干細胞難以到達椎間盤組織[3]。故椎間盤在長期的上身負荷下易發(fā)生退變。也正是椎間盤持續(xù)的退變，導致椎間盤內(nèi)組織水分降低，細胞外基質(zhì)增加，細胞數(shù)目大幅度降低，組織鈣化等病理改變[4-5]。

隨著干細胞與再生醫(yī)學的興起，人們對干細胞的生物特性的了解不斷深入，給椎間盤退變的治療帶來了新的希望。如何有效獲取干細胞，成為椎間盤退變生物治療的關鍵。本文根據(jù)前期的研究，改進了髓核組織的消化方法，通過低密度接種培養(yǎng)，獲取細胞集落，后通過多向分化及單克隆形成能力檢測，驗證該細胞集落具有干細胞特性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 4周齡SD大鼠10只，雌雄不限，體質(zhì)量100～200 g，由江蘇省南京市青龍山動物研究中心提供。

1.2 實驗試劑 0.25%EDTA-胰酶(Gibco)，0.2%Ⅰ型膠原酶(Sigma),青霉素-鏈霉素溶液(15070063，Gibco)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(SH30256.01,hyclone)，DMEM/F12培養(yǎng)基(Gibco),干細胞胎牛血清(Gibco)，干細胞成骨分化誘導培養(yǎng)基(A1007201，Gibco)，干細胞成脂肪分化誘導培養(yǎng)基(A1007001，Gibco)，干細胞成軟骨分化誘導培養(yǎng)基(A1007101，Gibco)，茜素紅染色液(南京森貝伽生物科技有限公司)，油紅O染色劑(O0625，Sigma),番紅染色液(南京森貝伽生物科技有限公司)，結晶紫染色劑(C8407，索萊寶)，10 cm培養(yǎng)皿。

1.3 實驗方法

1.3.1 獲取大鼠尾椎髓核原代細胞(nucleus pulposus cells，NPCs) 取4周齡SD大鼠幼鼠10只，給予頸椎脫臼法處死后，全部浸沒于75%的酒精10 min，無菌條件下分離大鼠尾椎C1～C5節(jié)段，解剖顯微鏡下分離椎間盤中央部分的髓核組織，將髓核都浸泡在含有雙抗的PBS中10 min，取出后PBS沖洗3次，加入0.25%EDTA-胰酶，置于37℃溫水浴箱中40 min后離心并棄上清，最后分別加入0.2%Ⅰ型膠原酶和重新置于水浴箱中消化1 h左右，每30 min震蕩1次以加速消化。待組織完全消化后用200目濾網(wǎng)過濾，1500 r/min離心5 min，棄上清，重新加入含有10%的FBS培養(yǎng)基吹打混勻，備用。整個獲取過程在2 h內(nèi)完成，以便于更好地保持髓核細胞的活性。

1.3.2 獲取大鼠尾椎髓核干細胞(nucleus pulposus stem cells，NPSCs) 將得到的NPCs吹打混勻，chamber計數(shù)板計數(shù)，按照50、100、200個/cm2的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿，每皿加入6～8 mL的含有20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱，每3 d換液1次，培養(yǎng)10 d。顯微鏡下觀察細胞集落的形態(tài)。用4%的多聚甲醛固定30 min，PBS沖洗3次后，再使用0.1%的結晶紫染色10 min，觀察集落形態(tài)，統(tǒng)計集落形成率，倒置相差顯微鏡下細胞數(shù)少于20個的集落忽略不計。

1.4 多向分化能力檢測 將上述得到的細胞集落經(jīng)0.25%的胰蛋白酶消化后進行體外擴增培養(yǎng)，取第2代細胞，按照每孔2×104的密度接種于24孔板，加入1 mL含有10%FBS的DMED/F12培養(yǎng)基，待細胞融合達80%，按如下步驟進行誘導分化。

加入成骨分化誘導培養(yǎng)基，每3 d換液1次，誘導21 d后，4%多聚甲醛固定細胞15 min，加入適量茜素紅染液染色30 min后，PBS輕輕沖洗2遍，倒置相差顯微鏡下觀察。

加入成脂肪分化誘導培養(yǎng)基，每3 d換液1次，每次換液時不要把原培養(yǎng)基全部吸出，誘導21 d后，如上方法進行細胞固定，油紅O染液染色30 min，然后蘇木素復染30 min，PBS沖洗后置于顯微鏡下觀察。

按照micromass法[6]進行成軟骨方向分化誘導，加入成軟骨分化誘導培養(yǎng)基，每3 d換液1次，誘導21 d，固定細胞，番紅染色30 min，沖洗后置于顯微鏡下觀察。

1.5 單克隆形成能力檢測 單克隆形成能力反映出細胞的強大增殖能力，據(jù)國外文獻報道，在接種密度<50個/cm2時[7]，只有具有干細胞性質(zhì)的細胞，才能得以生存下來。我們將獲得的細胞集落使用0.25%的胰蛋白酶消化后，收集細胞懸液，按照50個/cm2的密度接種于10 cm培養(yǎng)皿上，加入8 mL含20%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱，每3 d換液一次，培養(yǎng)15 d后，結晶紫染色，觀察是否有細胞集落形成。

2 結果

2.1 NPCs與NPSCs形態(tài)學比較 NPCs接種后，大約48 h貼壁，形態(tài)多不規(guī)則，呈三角形或不規(guī)則四邊形，倒置相差顯微鏡下可見細胞內(nèi)部含有較多“空泡”(圖1A)。髓核細胞按照不同密度接種培養(yǎng)后，3 d后可見細胞貼壁(圖1B)，5 d見貼壁細胞增殖形成細胞集落(圖1C)。隨著培養(yǎng)時間的延長，10 d時，可見較大形態(tài)的細胞集落形成。高倍鏡下觀察，細胞多呈梭形，內(nèi)部無“空泡”結構(圖1D)。

2.2 多向分化能力 含鈣基質(zhì)可以被茜素紅染液染成紅色或者鮮紅色。在誘導成骨分化4 d，使用多聚甲醛固定細胞后，經(jīng)茜素紅染色，顯微鏡下可見視野大片被染成深紅色含鈣骨基質(zhì)。油紅O為脂溶性染料，在脂肪內(nèi)能高度溶解，可特異性的使組織內(nèi)甘油三酯等中性脂肪著色。在成脂肪分化誘導15 d左右，輕輕吸取上清液，多聚甲醛固定，實驗組加入適量油紅O染色劑，顯微鏡下可見細胞內(nèi)有較多透亮的紅色脂肪滴。

番紅染色原理在于嗜堿性的軟骨與堿性染料番紅結合呈現(xiàn)紅色。在成軟骨誘導18 d左右，經(jīng)番紅染色，可見實驗組有軟骨片被染成深紅色。見圖2。

A.NPCs呈不規(guī)則三角形，內(nèi)部含有較多“空泡”結構;B～D.髓核細胞按照不同密度接種培養(yǎng)。不同時間內(nèi)細胞集落的形態(tài)變化。B.接種3 d后，可見已經(jīng)貼壁的細胞增殖形成較小的細胞集落;C.接種培養(yǎng)5 d，細胞集落逐漸變大;D.接種培養(yǎng)10 d，可見均一的呈圓形的細胞集落。

圖1 NPCs與NPSCs形態(tài)比較

A.成骨方向分化，含鈣基質(zhì)被茜素紅染成鮮紅色;B.成脂肪方向分化，細胞內(nèi)脂肪滴被油紅O染成亮紅色;C.成軟骨方向分化，可見大片的軟骨基質(zhì)被染成深紅色。

圖2 NPSCs三系分化

2.3 單克隆形成能力檢測 在進行單克隆能力檢測時，高倍顯微鏡下可見集落中的細胞形態(tài)大部分呈規(guī)則的梭形，細胞內(nèi)部無“空泡”。結晶紫染色，肉眼可見被染成紫色的細胞集落。見圖3。

3 討論

近幾年隨著組織工程學的興起，干細胞及相關臨床轉(zhuǎn)化[8-9]引起人們的高度重視，椎間盤缺乏血供，無神經(jīng)支配，生理狀態(tài)下處于長期封閉的腔隙內(nèi)，因此，椎間盤組織可以逃避細胞免疫及體液免疫，成為“免疫豁免”[10-11]的組織之一。目前向發(fā)生退變的椎間盤移植干細胞有兩種途徑：移植技術及載體。正是椎間盤這種“免疫豁免”的特性，我們可以向椎間盤內(nèi)直接注射干細胞，在動物模型[12]和人體模型[13]中，這種方法已經(jīng)被證實對于治療椎間盤退變有明顯作用。但是干細胞直接注射治療也存在很多缺點，由于干細胞具有多向分化的特性，在注射時若發(fā)生泄露，在脊柱峽部會發(fā)生骨化而造成椎管狹窄[14]。細胞載體很好地解決了這個問題，載體一方面可以防止細胞泄露，另一方面可以提供干細胞生長的微環(huán)境。包括凝膠載體和生物載體，前者包括膠原蛋白凝膠、透明質(zhì)酸凝膠等，后者包括微球支架[15]和其他生物增強支架[16]等。

A.高倍鏡下集落中的細胞形態(tài);B.單克隆形成能力檢測，按照不同密度接種培養(yǎng)得到的細胞集落再次進行單克隆后，依然具有低密度形成細胞集落的能力。

圖3 NPSCs單克隆形成能力檢測

本實驗將NPCs低密度接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，將獲得的細胞集落進行了多向分化誘導和單克隆形成能力檢測，可以初步判斷通過該法獲得的細胞具有干細胞特性，也符合干細胞鑒定標準。當然，本文也存在不足，未進行免疫學鑒定，但是目前關于成體干細胞的研究還屬于初步階段，很多成體干細胞表面的標記物還是未知的，需要我們進一步去完善。NPSCs的分離與鑒定，經(jīng)過進一步的研究與完善，將有望解決種子細胞來源問題，為今后的組織工程奠定良好基礎。