棉花黃萎病菌拮抗酵母菌篩選及鑒定

文雨婷，張 媱，李 楊，孫燕飛，雷勇輝，王 翀

(1.石河子大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆 石河子 832003； 2.石河子大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆 石河子 832003；3.新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，新疆 烏魯木齊 830063)

棉花是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，在我國(guó)的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中占有舉足輕重的地位。新疆是我國(guó)最大的棉花產(chǎn)區(qū)，隨著新疆棉花生產(chǎn)的規(guī)模化和棉花輪作模式的普及化[1]，棉花黃萎病的發(fā)生變得更加迅猛。棉花黃萎病的發(fā)病期明顯提前，并且危害顯著加重，已經(jīng)嚴(yán)重地制約新疆棉花生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)引起的一種土傳真菌病害，病菌具有分布廣、危害重、寄主范圍寬、傳播途徑多、存活時(shí)間久等特點(diǎn)[2-3]，現(xiàn)階段缺乏有效防治棉花黃萎病的手段。除了對(duì)棉花黃萎病抗性的研究，生產(chǎn)中多使用化學(xué)農(nóng)藥防治棉花黃萎病，但該方法存在嚴(yán)重的環(huán)境破壞問(wèn)題[4-5]，生物防治可降低甚至避免這些危害。前人已篩選得到許多對(duì)棉花黃萎病菌有較好防治作用的生防菌株，主要有木霉(Trichoderma)[6]、芽孢桿菌(Bacillus)[7]、假單胞菌(Pseudomonas)[8]、鏈霉菌(Streptomyces)[9]、毛殼菌(Chaetomium)[10]等。一些研究證明，從植物內(nèi)部、表皮及根際分離出的微生物可以在一定程度上直接或間接降低植物病原菌的危害[11-13]，而酵母菌是植物附生微生物的重要組成部分，較其他微生物而言具有遺傳穩(wěn)定、抑菌譜廣、抗逆性強(qiáng)、安全性高等特點(diǎn)，因此常被用作病原菌的生物控制劑[14-16]。目前，利用酵母菌防治棉花黃萎病的研究鮮有報(bào)道，同時(shí)由于生防菌劑具有明顯的地域性，跨地域使用往往效果欠佳。新疆地區(qū)含有豐富的酵母菌資源，因此，以新疆地區(qū)分離的酵母菌株為對(duì)象，篩選能夠抑制棉花黃萎病菌生長(zhǎng)的酵母菌，為利用酵母菌防治棉花黃萎病提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株：石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物生態(tài)實(shí)驗(yàn)室保存的黃萎病菌VD911及從新疆地區(qū)果園、甜菜地、活性污泥等土壤中或水果表皮分離純化獲得的230株酵母菌。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖(YEPD)培養(yǎng)基、糖類發(fā)酵培養(yǎng)基、碳源同化培養(yǎng)基。

1.2 拮抗酵母菌的篩選

采用平板對(duì)峙法[17-18]，在PDA固體培養(yǎng)基中心放置直徑為8 mm的黃萎病菌菌餅，將待篩酵母菌點(diǎn)接于距菌餅2.5 cm處，以不接種酵母菌的培養(yǎng)基為空白對(duì)照，觀察酵母菌附近黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)的情況。瓊脂塊法參照文獻(xiàn)[19]，挑取直徑為7 mm、有抑菌活性的酵母菌菌餅，分別接種于孢子濃度為104、105、106cfu/mL(挑取黃萎病菌菌絲于PDA液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d，用4層紗布過(guò)濾，收集孢子濾液，計(jì)數(shù)待用)的黃萎病菌平板上，7 d后觀察拮抗酵母菌的抑菌效果并測(cè)量其抑菌圈直徑，每組試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 拮抗酵母菌形態(tài)觀察及生理生化特性檢測(cè)

將篩選獲得的酵母菌株在 YEPD 培養(yǎng)基平板上劃線接種，28 ℃培養(yǎng) 2～5 d后進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，記錄菌落特征；將菌種接種于YEPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng) 24 h ，取樣在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。酵母菌的生理生化鑒定方法參照《The yeasts: A taxonomic study》[20]。

1.4 拮抗酵母菌系統(tǒng)發(fā)育分析

將篩選獲得的酵母菌接種于20 mL YEPD 液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，離心收集菌體，用十六烷基三甲基溴化銨(Cetyl trimethyl ammonium bromide，CTAB)法提取DNA后進(jìn)行26S rDNA 的PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增采用酵母26S rDNA通用引物NL-1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′和NL-4：5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′。PCR體系及程序參照文獻(xiàn)[21]并加以改進(jìn)。擴(kuò)增體系共25 μL：10×TaqBuffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，NL-1 1 μL，NL-4 1 μL，DNA 2 μL，TaqDNA聚合酶0.625 μL，ddH2O 14.375 μL。PCR 程序?yàn)椋?4 ℃ 10 min；94 ℃ 1 min，56 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。將擴(kuò)增出的26S rDNA序列送上海生工生物工程有限公司測(cè)序。登錄NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)用BLAST程序進(jìn)行序列比對(duì)，下載序列，通過(guò)MEGA 6.0軟件進(jìn)行分析并構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗酵母菌篩選

通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)，從230株酵母菌篩選獲得ZHB39、19-10、F3、S4B2-13、T1、MLY1共6株效果較好的拮抗酵母菌株(圖1)。隨后在不同孢子濃度的黃萎病菌平板上接種拮抗酵母菌，對(duì)比其抑菌圈大小發(fā)現(xiàn)，隨著黃萎病菌孢子濃度的降低，拮抗酵母菌的抑菌活性增加。當(dāng)黃萎病菌孢子濃度為104cfu/mL時(shí)，拮抗酵母菌的抑菌圈直徑最大，此時(shí)6株拮抗酵母菌的抑菌圈直徑分別為12.50、13.83、16.33、25.17、21.83、11.17 mm。其中，S4B2-13的抑菌活性顯著優(yōu)于其他5株酵母菌，T1的抑菌活性顯著優(yōu)于MLY1、ZHB39、19-10和F3，F(xiàn)3的抑菌活性顯著優(yōu)于MLY1、ZHB39和19-10(表1)。但由圖1可知，S4B2-13和T1產(chǎn)生的抑菌圈內(nèi)仍有少許黃萎病菌菌絲生長(zhǎng)，而F3形成的抑菌圈中無(wú)任何黃萎病菌菌絲的生長(zhǎng)。

A：空白對(duì)照；B：接種拮抗酵母菌株MLY1；C：接種拮抗酵母菌株ZHB39；D：接種拮抗酵母菌株19-10；E：接種拮抗酵母菌株F3；F：接種拮抗酵母菌株T1；G：接種拮抗酵母菌株S4B2-13；H：6株拮抗酵母菌產(chǎn)生的抑菌圈大小圖1 拮抗酵母菌篩選

表1 拮抗酵母菌的抑菌圈直徑 mm

注：同列不同字母代表不同菌株的抑菌圈直徑差異顯著(P<0.05)。

2.2 拮抗酵母菌的形態(tài)特征

本試驗(yàn)共篩選獲得6株拮抗棉花黃萎病菌的酵母菌，其形態(tài)特征各不相同(圖2、表2)。其中ZHB39、T1和MLY1菌落邊緣整齊，而19-10邊緣不整齊，F(xiàn)3邊緣生出類似根狀的分支，S4B2-13呈絲狀；ZHB39和T1菌落隆起呈枕狀，19-10呈臍凹狀，F(xiàn)3隆起呈臍凸?fàn)?，S4B2-13隆起呈扁平狀，MLY1稍拱起；ZHB39、19-10、F3、S4B2-13和T1菌落不透明，而MLY1呈膠狀。ZHB39和F3的菌體形態(tài)呈橢圓形，19-10呈圓形，S4B2-13呈鞋形，T1呈檸檬形，MLY1呈長(zhǎng)桿狀。因此，從菌落和菌體的差異上認(rèn)為篩選出的6個(gè)拮抗菌株屬于不同的酵母菌。

圖2 拮抗酵母菌的菌落和菌體形態(tài)

表2 拮抗酵母菌菌落菌體形態(tài)及相近物種序列相似性分析

2.3 拮抗酵母菌系統(tǒng)發(fā)育分析

對(duì)6株拮抗酵母菌進(jìn)行26S rDNA 的PCR擴(kuò)增，獲得大小為 500～600 bp的目的片段，登錄NCBI網(wǎng)站用BLAST程序進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ZHB39、19-10、F3、S4B2-13、T1和MLY1的相近物種分別為美極梅奇酵母(Metschnikowiapulcherrima)、Kazachstaniazonata、美極梅奇酵母、威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)、葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)和Barnettozymacalifornica，其遺傳相似性均大于98%，且E值均為0(表2)。對(duì)拮抗酵母菌和其相似物種利用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖3所示，19-10與Kazachstania屬的酵母菌聚集于一個(gè)大的遺傳分支，但與該屬中的標(biāo)準(zhǔn)株距離較遠(yuǎn)；F3和ZHB39與梅奇酵母屬(Metschnikowia)的酵母菌聚集于一個(gè)大的遺傳分支，并且F3和ZHB39又形成一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的遺傳分支，親緣關(guān)系較近，但與該屬的標(biāo)準(zhǔn)株距離較遠(yuǎn)；T1與漢遜酵母屬(Hanseniaspora)的酵母菌聚集于一個(gè)大的遺傳分支，并與葡萄汁有孢漢遜酵母在該遺傳分支中進(jìn)一步形成一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的遺傳分支；MLY1與Barnettozyma屬的酵母菌聚集于一個(gè)大的遺傳分支，但與該屬中的標(biāo)準(zhǔn)株距離較遠(yuǎn)；S4B2-13與威克漢姆酵母聚集于一個(gè)遺傳分支。因此，初步認(rèn)為ZHB39、19-10、F3、S4B2-13、T1和MLY1這6株拮抗酵母菌分別為梅奇酵母菌(Metschnikowiasp.)、Kazachstaniasp.、梅奇酵母菌、威克漢姆酵母、葡萄汁有孢漢遜酵母和Barnettozymasp.。

圖3 基于26S rDNA序列構(gòu)建的拮抗酵母菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 拮抗酵母菌的生理生化特性

根據(jù)6株酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，并參照《The yeasts: A taxonomic study》[20]手冊(cè)，進(jìn)一步對(duì)6株酵母菌進(jìn)行相關(guān)生理生化特性檢測(cè)，對(duì)其種屬地位進(jìn)行最終確定。糖發(fā)酵試驗(yàn)表明，6株拮抗酵母菌均可利用葡萄糖進(jìn)行發(fā)酵，但S4B2-13還能利用蔗糖進(jìn)行發(fā)酵，19-10還能利用蔗糖、麥芽糖和棉籽糖進(jìn)行發(fā)酵(表3)。碳源利用試驗(yàn)結(jié)果表明(表4)，ZHB39和F3均能利用葡萄糖、蔗糖、半乳糖、海藻糖、乙醇、甘油、D-甘露醇、麥芽糖、松三糖、甲基-吡喃葡萄糖、纖維二糖、水楊苷、D-山梨醇、琥珀酸鈉、檸檬酸鹽、葡萄糖酸鹽、D-葡萄糖胺和鯨蠟烷等碳源進(jìn)行同化作用，19-10能利用葡萄糖、菊粉、蔗糖、棉籽糖和麥芽糖等碳源進(jìn)行同化作用，S4B2-13能利用葡萄糖、蔗糖、棉籽糖、海藻糖、乙醇、甘油、赤蘚糖醇、麥芽糖、松三糖、甲基-吡喃葡萄糖、可溶性淀粉、纖維二糖、水楊苷、D-甘露醇、D-山梨醇、乳酸鈉、琥珀酸鈉和檸檬酸鹽等碳源進(jìn)行同化作用，T1能利用葡萄糖、纖維二糖和水楊苷等碳源進(jìn)行同化作用，MLY1能利用葡萄糖、乙醇、甘油、D-甘露醇、纖維二糖、水楊苷、L-山梨糖、D-木糖、乳酸鈉、琥珀酸鈉和葡萄糖酸鹽等碳源進(jìn)行同化作用。溫度、高滲、尿素酶、無(wú)維生素等生理生化特性檢測(cè)結(jié)果表明(表5)，除MLY1最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃外，其余酵母菌均為38 ℃；6株酵母菌均能在50%葡萄糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，不能在無(wú)維生素培養(yǎng)基中生長(zhǎng)；ZHB39、19-10、F3能產(chǎn)生弱的尿素酶反應(yīng)，MLY1產(chǎn)生強(qiáng)尿素酶反應(yīng)，S4B2-13和T1不能進(jìn)行尿素酶反應(yīng)。經(jīng)鑒定，19-10是Kazachstaniasp.，S4B2-13是威克漢姆酵母，T1是葡萄汁有孢漢遜酵母，MLY1是Barnettozymacalifornica，ZHB39和F3是美極梅奇酵母。6株拮抗酵母菌的一些生理生化特性如溫度、尿素酶反應(yīng)等與《The yeasts: A taxonomic study》[20]上記錄的略有差異，推測(cè)可能是同一個(gè)種不同亞種之間的區(qū)別。

表3 拮抗酵母菌糖發(fā)酵檢測(cè)結(jié)果

注：+代表發(fā)酵；v代表部分發(fā)酵，部分不發(fā)酵；-代表不發(fā)酵。

表4 拮抗酵母菌碳源利用試驗(yàn)結(jié)果

注：+代表強(qiáng)同化；w代表弱同化；v代表部分同化，部分不同化；—代表不同化；n代表無(wú)數(shù)據(jù)。

表5 拮抗酵母菌部分生理生化特性檢測(cè)結(jié)果

注：+代表生長(zhǎng)或反應(yīng)；w代表弱生長(zhǎng)或弱反應(yīng)；-代表不生長(zhǎng)或不反應(yīng)。

3 結(jié)論與討論

本研究共獲得6株拮抗棉花黃萎病菌的酵母菌，分別為ZHB39、19-10、F3、S4B2-13、T1和MLY1，經(jīng)鑒定，19-10是Kazachstaniasp.，S4B2-13是威克漢姆酵母(Wickerhamomycesanomalus)，T1是葡萄汁有孢漢遜酵母(Hanseniasporauvarum)，MLY1是Barnettozymacalifornica，ZHB39和F3是美極梅奇酵母(Metscgnikowiapulcherrima)。6株拮抗酵母菌在黃萎病菌孢子濃度為104cfu/mL時(shí)，抑菌圈直徑最大，分別為12.50、13.83、16.33、25.17、21.83、11.17 mm，均具有較好的抑菌能力。

近年來(lái)，有許多關(guān)于酵母菌防治植物病害的研究報(bào)道，尤其在酵母菌對(duì)水果采后病害的防治中，靳莎莎等[22]篩選出1株抑制草莓灰霉病和根霉病的拮抗酵母菌卡利比克畢赤酵母菌(Pichiacaribbica)，并且發(fā)現(xiàn)在一定條件下，灰霉病和根霉病的腐爛率可被完全抑制；高云慨等[23]研究表明，季也蒙畢赤酵母菌(Meyerozymaguilliermondii)可有效抑制芒果炭疽病。已報(bào)道的拮抗酵母菌主要有紅酵母菌(Rhodotorulasp.)[24]、葡萄汁有孢漢遜酵母菌[25]、梅奇酵母菌(Metscgnikowiasp.)[26]、檸檬克勒克酵母菌(Kloeckeraapiculata)[27]、隱球酵母菌(Cryptococcussp.)[28]、假絲酵母菌(Candidasp.)[29]等。而關(guān)于Kazachstaniasp.和Barnettozymacalifornica防治植物病害的研究幾乎沒(méi)有報(bào)道，威克漢姆酵母菌多用于發(fā)酵，也幾乎沒(méi)有關(guān)于防治植物病害的研究，本研究發(fā)現(xiàn)Kazachstaniasp.、威克漢姆酵母菌、Barnettozymacalifornica對(duì)于棉花黃萎病菌有一定的抑制作用，這對(duì)酵母菌防治植物病害的研究具有重要意義。在酵母抑制植物病原菌的研究中，張建等[30]發(fā)現(xiàn)，德巴利酵母菌(Debaryomycessp.)I8對(duì)蟠桃根腐病菌的抑菌圈直徑為17.20 mm；任少東等[31]發(fā)現(xiàn)，拮抗酵母菌對(duì)致病菌的平均抑菌圈直徑為20～30 mm。在生防菌抑制棉花黃萎病菌的研究中，陳麗華等[32]試驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)生芽孢桿菌LH-L3對(duì)棉花黃萎病菌的抑菌圈直徑為25.00 mm；劉海洋等[33]試驗(yàn)結(jié)果表明，甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌AL7的脂肽粗提取物對(duì)棉花黃萎病菌的抑菌圈直徑為36.1 mm；金利容等[34]試驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)生惡臭假單胞菌HB3S-20菌株對(duì)棉花黃萎病菌的抑菌圈直徑為13.70 mm。本試驗(yàn)篩選出的拮抗酵母菌S4B2-13對(duì)棉花黃萎病菌的抑菌圈直徑為25.17 mm，T1對(duì)棉花黃萎病菌的抑菌圈直徑為21.83 mm，均具有較強(qiáng)的抑菌效果，可進(jìn)一步進(jìn)行盆栽試驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究共獲得6株拮抗棉花黃萎病菌的酵母菌株，其中ZHB39和F3均屬于美極梅奇酵母，但兩者間的抑菌能力有差異，并且菌落形態(tài)也不相同，推測(cè)ZHB39和F3可能屬于同種間不同亞種，因此，下一步應(yīng)對(duì)其抑制黃萎病菌的有效成分進(jìn)行檢測(cè)和確定。19-10的生理生化特性與Kazachstaniasp.中相似種的生理生化特性均有差異，故很有可能是新菌種，還需進(jìn)一步進(jìn)行5.8S-ITS序列分析和更多理化因子測(cè)定。對(duì)于拮抗酵母的拮抗因子和抑菌效果，還需要進(jìn)一步進(jìn)行代謝產(chǎn)物分離檢測(cè)和相應(yīng)的盆栽及大田試驗(yàn)。