產(chǎn)聚谷氨酸菌株的篩選及其發(fā)酵物對(duì)辣椒生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響

王 進(jìn)，高 鵬，黃天悅，陳孝平

(武漢工程大學(xué) 環(huán)境生態(tài)與生物工程學(xué)院，湖北 武漢 430205)

聚谷氨酸(γ-Polyglutamic acid，γ-PGA)是由L-谷氨酸(L-Glu)、D-谷氨酸(D-Glu)通過(guò)γ-酰胺鍵結(jié)合形成的一種多肽[1]，其與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)類似，但不具有蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)。γ-PGA具有強(qiáng)吸水性、可吸附金屬離子、可降解和良好的生物親和性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品、化妝品以及污水處理等諸多領(lǐng)域[2-4]。在農(nóng)業(yè)方面，γ-PGA常被用作肥料增效劑和緩釋劑[5-6]。由于γ-PGA具有強(qiáng)吸水性，且側(cè)鏈殘基帶有大量的負(fù)電荷，故γ-PGA能夠保持土壤水分，吸附陽(yáng)離子如NH4+、K+等以保持土壤肥力。此外，γ-PGA還能螯合部分重金屬離子[7]，改善土壤環(huán)境，利于植物生長(zhǎng)。

γ-PGA最初被發(fā)現(xiàn)于炭疽芽孢桿菌，后來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬的其他菌種如枯草芽孢桿菌、納豆芽孢桿菌等也有產(chǎn)γ-PGA能力。最近幾年，枯草芽孢桿菌常被用作研究γ-PGA的模式菌株。γ-PGA產(chǎn)生菌常見(jiàn)于豆類制品中。謝婷等[8]從多種豆類發(fā)酵食品中篩得高產(chǎn)γ-PGA的枯草芽孢桿菌并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。禚優(yōu)優(yōu)等[9]從豆豉中篩到1株產(chǎn)γ-PGA的枯草芽孢桿菌，并將提純的 γ-PGA應(yīng)用于蕪青油菜盆栽試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)γ-PGA具有增肥效果。賈艷萍等[10]從豆豉和納豆中分離篩選到2株產(chǎn)γ-PGA的菌株，經(jīng)鑒定均為枯草芽孢桿菌，通過(guò)將其發(fā)酵液和蒸餾水分別添加到土壤中測(cè)失水率發(fā)現(xiàn)，γ-PGA發(fā)酵液具有保水性。與豆類制品來(lái)源菌相比，土壤來(lái)源的γ-PGA產(chǎn)生菌篩選難度更大，但同時(shí)獲得的菌株更穩(wěn)定且抗逆性較強(qiáng)。普通土壤難以篩選到γ-PGA產(chǎn)生菌，γ-PGA為芽孢桿菌莢膜的主要成分，能使菌體在高鹽環(huán)境下吸收水分，產(chǎn)生耐鹽性。依據(jù)這一點(diǎn)，姚俊等[11]從沿海地區(qū)采集鹽分較高的土壤，并成功篩選到多株γ-PGA產(chǎn)生菌。芽孢桿菌因其良好的抗逆性和土壤適應(yīng)能力常被用作微生物菌肥。目前，肥料增效方面的研究都是通過(guò)發(fā)酵提純的γ-PGA與化肥混合來(lái)實(shí)施的，而產(chǎn)γ-PGA的菌株多為芽孢桿菌，可作為菌肥使用。為此，從1棵長(zhǎng)勢(shì)良好的梨樹(shù)下采集土壤(鹽分偏高)，篩選產(chǎn)γ-PGA菌株，對(duì)其進(jìn)行鑒定，并對(duì)其固體發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，然后以固體發(fā)酵物為菌肥，研究其對(duì)辣椒生長(zhǎng)和產(chǎn)量的影響，以期為γ-PGA菌肥的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

土壤為果園梨樹(shù)表層(10～15 cm)土壤。

LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂15～20 g/L，用NaOH溶液調(diào)pH值至7.2，于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：配方同LB固體培養(yǎng)基，額外添加1 g/L葡萄糖，但不加瓊脂，于高壓滅菌鍋中121 ℃ 滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：檸檬酸三鈉16.8 g/L、L-Glu 20 g/L、甘油 80 g/L、NH4Cl 7 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、MnSO4·H2O 0.1 g/L、CaCl20.15 g/L、FeCl3·6H2O 0.04 g/L，用NaOH溶液調(diào)pH值至7.4，于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。

固體培養(yǎng)基：固體基質(zhì)(豆渣、酒糟、玉米粉)10 g、K2HPO40.025 g、MgSO4·7H2O 0.025 g、MnSO4·H2O 0.005 g、CaCl20.0075 g、FeCl3·6H2O 0.002 g，于高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 產(chǎn)γ-PGA菌株的篩選 將土壤和豆豉放置于通風(fēng)陰涼處，風(fēng)干7 d，過(guò)孔徑150 μm篩。分別取2 g土壤、豆豉樣品與10 mL無(wú)菌水混合，振蕩5 min,靜置30 min。取1.5 mL上清液于EP管中，置于沸水中10 min,然后取1 mL處理好的上清液至盛有9 mL無(wú)菌水的試管中，進(jìn)行稀釋涂布。將涂布好的平板于37 ℃培養(yǎng)12 h。挑取高黏濕潤(rùn)并且能拉絲的單菌落進(jìn)行劃線保存。

1.2.2 產(chǎn)γ-PGA菌株發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定 接種保存好的菌株于種子培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)14 h。然后按照3%接種量接種到含50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，37 ℃培養(yǎng)72 h。用濃鹽酸將發(fā)酵菌液的pH值調(diào)至3.2，10 000 r/min離心20 min，收集上清液，將上清液加到截留分子質(zhì)量為14 ku的透析袋中，用加有5 g/L顆?；钚蕴康某兯肝錾锨逡褐翢o(wú)色，然后將透析袋放入超純水中4 ℃透析過(guò)夜。將透析液用旋蒸儀濃縮，向濃縮液中加入4倍體積預(yù)冷的無(wú)水乙醇，置于搖床上振蕩30 min，收集白色沉淀物，進(jìn)行真空冷凍干燥，得到乳白色粉狀固體。稱取0.1 g乳白色粉狀固體于1 mL蒸餾水中配制成100 g/L溶液，取500 μL上述溶液于等體積的濃鹽酸中，用安剖瓶密封后在110 ℃下水解24 h。用毛細(xì)管點(diǎn)上述水解液于硅膠板上，以100 g/L的L-谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品γ-PGA為對(duì)照，以茚三酮為顯色劑，測(cè)定菌株產(chǎn)物是否為γ-PGA。

1.2.4 產(chǎn)γ-PGA菌株16S rDNA序列分析 將篩選到的產(chǎn)γ-PGA菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取總基因組DNA。以菌株的基因組DNA為模板，采用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系包含模板DNA 2 μL，Taq酶(5 U/μL)0.2 μL，10×TaqBuffer(含Mg2+)2.5 μL，dNTPs(各2.5 mmol/L) 2 μL，上、下游引物(1 μmol/L)各5 μL，ddH2O 8.3 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保溫。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA凝膠電泳，在紫外光照下將目的條帶膠塊用刀片切下，用DNA回收試劑盒進(jìn)行純化回收。將純化的DNA片段送至生工生物工程(上海)有限公司測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，用MEGA 6.0對(duì)菌株的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.2.5 產(chǎn)γ-PGA菌株固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化

1.2.5.1 最佳固體基質(zhì)的確定 取一定量滅菌后的固體培養(yǎng)基加入無(wú)菌水分別使豆渣、酒糟、玉米粉質(zhì)量濃度為20、40、60、80、100 g/L，3個(gè)重復(fù)，分別接種1.5 mL培養(yǎng)12 h的產(chǎn)γ-PGA菌株的菌液，置于恒溫?fù)u床中37 ℃培養(yǎng)72 h。取1 mL培養(yǎng)物于9 mL無(wú)菌水中，充分振蕩混勻，靜置30 min后，取上清進(jìn)行稀釋涂布。37 ℃培養(yǎng)12 h后計(jì)數(shù)，找出最佳固體基質(zhì)。

1.2.5.2 培養(yǎng)基含水量的確定 用確定的最優(yōu)固體基質(zhì)配制培養(yǎng)基，加無(wú)菌水使其含水量分別達(dá)到50%、55%、60%、65%、70%，3個(gè)重復(fù)，接種1 mL培養(yǎng)12 h的產(chǎn)γ-PGA菌株的菌液，37 ℃培養(yǎng)7 d。取樣1 g，進(jìn)行稀釋涂布并計(jì)數(shù)，確定最佳含水量。

1.2.6 產(chǎn)γ-PGA菌株對(duì)辣椒生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響 試驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)處理:50 g滅菌土不加任何物質(zhì)(T1)、50 g滅菌土與10 g滅菌的固體培養(yǎng)基混合(T2)、50 g滅菌土與10 g固體菌株發(fā)酵物混合(T3)。由于后期需要施肥，所以首先確定哪種氮肥更利于菌體生長(zhǎng)。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在NH4Cl、(NH4)2SO4、尿素3種氮肥中，最有利于菌體生長(zhǎng)的氮肥為(NH4)2SO4。用從華中農(nóng)業(yè)大學(xué)購(gòu)得的辣椒苗和校園里挖的土進(jìn)行盆栽。盆栽前，先按照已經(jīng)確定的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行固體發(fā)酵。稱取4.71 g (NH4)2SO4和3.89 g KH2PO4溶于100 mL水中，用于后續(xù)施肥。2017年4月15日開(kāi)始定植，每組10盆，每天定時(shí)澆足量的水，每周一澆水前施肥，每盆施1 mL肥料溶液。2017年7月10日開(kāi)始收獲，對(duì)株高、根長(zhǎng)、掛果數(shù)、莖粗、產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)γ-PGA菌株菌落的形態(tài)特征與菌體的革蘭氏染色情況

經(jīng)篩選，從果園土壤中發(fā)現(xiàn)1個(gè)菌株WJ47的菌落呈淡黃色、不透明，邊緣不整齊，表面濕潤(rùn)，中間有突起黏液(圖1)。光學(xué)顯微鏡下的革蘭氏染色結(jié)果如圖2所示，WJ47菌體形態(tài)呈短桿狀，革蘭氏染色結(jié)果為陽(yáng)性。由此，初步斷定WJ47屬于芽孢桿菌屬。

圖1 WJ47菌株菌落形態(tài)

圖2 WJ47菌株的革蘭氏染色情況

2.2 產(chǎn)γ-PGA菌株發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定及黏均分子質(zhì)量

2.2.1 發(fā)酵產(chǎn)物鑒定 由圖3可知，WJ47菌株的發(fā)酵產(chǎn)物水解液和標(biāo)準(zhǔn)品γ-PGA的水解液遷移值相同，表明WJ47菌株的發(fā)酵產(chǎn)物為γ-PGA。

2.2.2 產(chǎn)物黏均分子質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)品γ-PGA和產(chǎn)γ-PGA菌株發(fā)酵產(chǎn)物γ-PGA的ηsp/c與c的關(guān)系如圖4、圖5所示，由外推法分別求出標(biāo)準(zhǔn)品γ-PGA的特性黏度為0.045 73 L/g，產(chǎn)γ-PGA菌株發(fā)酵產(chǎn)物γ-PGA的特性黏度為0.088 28 L/g，再將其分別帶入到[η]=KMη1.49，已知標(biāo)準(zhǔn)品的分子質(zhì)量為700 ku，可以計(jì)算出產(chǎn)γ-PGA菌株發(fā)酵產(chǎn)物γ-PGA的黏均分子質(zhì)量為1 088 ku。

1、2、3分別表示L-谷氨酸、土壤來(lái)源菌株產(chǎn)物水解液、標(biāo)準(zhǔn)品γ-PGA水解液，圖3 土壤來(lái)源菌株發(fā)酵產(chǎn)物染色情況

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品γ-PGA溶液黏度與濃度關(guān)系

圖5 產(chǎn)物γ-PGA溶液黏度與濃度關(guān)系

2.3 產(chǎn)γ-PGA菌株的16S rDNA序列分析

基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析(圖6)發(fā)現(xiàn)， WJ47為芽孢桿菌屬(Bacillus)，在親緣關(guān)系上與枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)最近。

2.4 產(chǎn)γ-PGA菌株的固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

2.4.1 基質(zhì) 由表1可知，在同等質(zhì)量濃度下，經(jīng)以豆渣為基質(zhì)的培養(yǎng)基培養(yǎng)后的WJ47菌落數(shù)遠(yuǎn)超以玉米粉和酒糟為基質(zhì)的培養(yǎng)基。因此，選用豆渣作為后續(xù)固體發(fā)酵基質(zhì)。

圖6 菌株WJ47與相關(guān)已知菌株基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表1 3種不同質(zhì)量濃度基質(zhì)對(duì)WJ47菌株生長(zhǎng)的影響cfu

2.4.2 含水量 由圖7可知，當(dāng)培養(yǎng)基含水量從50%增加到55%時(shí)，WJ47菌落數(shù)稍微增加；當(dāng)培養(yǎng)基含水量從55%增加到60%時(shí)，WJ47菌落數(shù)直線上升；當(dāng)培養(yǎng)基含水量從60%增加到70%時(shí)，WJ47菌落數(shù)持續(xù)增加，但是增加幅度較小。因此，采用含水量60%的豆渣培養(yǎng)基進(jìn)行固體發(fā)酵。

圖7 不同固體培養(yǎng)基含水量對(duì)WJ47菌株生長(zhǎng)的影響

2.5 產(chǎn)γ-PGA菌株對(duì)辣椒生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響

由表2可知，與不含菌肥的T1處理相比，含有豆渣的T2、T3處理辣椒的株高、根長(zhǎng)、掛果數(shù)、莖粗和產(chǎn)量均得到顯著提高。這表明，豆渣作為菌肥的一部分，能有效促進(jìn)辣椒植株的生長(zhǎng)并提高辣椒產(chǎn)量。與不含WJ47菌株的T2處理相比，T3處理辣椒的株高、掛果數(shù)、莖粗等生長(zhǎng)指標(biāo)均顯著提高，進(jìn)而產(chǎn)量顯著提高47%。這表明，WJ47菌株促進(jìn)了辣椒的生長(zhǎng)，并顯著提高了辣椒的產(chǎn)量。綜上，菌肥中的豆渣和WJ47菌株均能顯著促進(jìn)辣椒植株的生長(zhǎng)，提高辣椒產(chǎn)量。

表2 產(chǎn)γ-PGA菌株對(duì)辣椒生長(zhǎng)及產(chǎn)量的影響

注：同行數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示處理之間差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

本研究從土壤中篩到1株產(chǎn)γ-PGA的枯草芽孢桿菌WJ47，其黏均分子質(zhì)量為1 088 ku。該菌株

的最佳固體發(fā)酵基質(zhì)為豆渣，固體培養(yǎng)基的最適含水量為60%。盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，WJ47菌株能促進(jìn)辣椒根系的生長(zhǎng)，并提高辣椒產(chǎn)量。

與T1處理相比，T2、T3處理辣椒的株高、根長(zhǎng)、產(chǎn)量、掛果數(shù)、莖粗等均得到顯著提高，表明菌肥中的豆渣能促進(jìn)辣椒的生長(zhǎng)。豆渣中氮含量比較高，這可能是豆渣促進(jìn)辣椒生長(zhǎng)的主要原因。均含有豆渣的T2、T3處理中，T3處理辣椒的株高、掛果數(shù)、莖粗等均顯著增加，且T3處理產(chǎn)量比T2處理顯著提高47%，說(shuō)明WJ47菌株能促進(jìn)辣椒的生長(zhǎng)，提高辣椒產(chǎn)量。與T2處理相比，T3處理含有WJ47菌株，能加速豆渣的腐化分解，為辣椒的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)。綜上，WJ47菌株能促進(jìn)辣椒根部的生長(zhǎng)，提高辣椒產(chǎn)量。