松香人工抗原的合成及多克隆抗體的制備

卞 歡, 仇新媛,2, 李鵬鵬, 陳 琳, 耿志明,*,王道營, 徐為民,3

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 江蘇 南京 210014；2.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院， 江蘇 南京 211816；3.江蘇省肉類生產(chǎn)與加工質(zhì)量安全控制協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京 210095)

松香是松樹含油樹脂蒸去松節(jié)油后得到的透明固體物質(zhì)，是用于制造肥皂、紙張、油漆涂料等的重要化工原料。松香主要由松香酸(abietic acid，AA)和脫氫松香酸(dehydroabietic acid，DHA)等組成，按照來源的不同，松香可分為脂松香、木松香和浮油松香[1-2]。AA和DHA可以導(dǎo)致皮膚過敏，而二者的氧化產(chǎn)物則被認為是主要的致敏物質(zhì)[3-4]。毒理學(xué)研究表明，AA和DHA可引起人體肺泡上皮細胞溶解，有損傷DNA的風(fēng)險[5-9]。

松香加熱熔融后具有良好的黏附特性，曾廣泛用于畜禽屠宰，尤其是鴨、鵝等水禽屠宰的二次脫毛加工。采用松香脫毛加工后，松香主要成分，如AA和DHA，會殘留在畜禽表皮組織中，并且難以通過后續(xù)的加工(腌制、蒸煮、烘烤等)有效去除[10-11]。2009年，我國頒布《食品安全法》，禁止在畜禽屠宰加工過程中使用松香二次脫毛。但在實際生產(chǎn)中，中小畜禽屠宰企業(yè)受利益驅(qū)動，違禁使用松香加工畜禽的現(xiàn)象依然十分嚴重，畜禽屠宰加工中非法使用松香脫毛的現(xiàn)象屢有媒體曝光，松香殘留導(dǎo)致的質(zhì)量安全隱患已引起社會關(guān)注。因此，建立健全并推廣實施畜禽肉制品中松香殘留的檢測方法，對于監(jiān)測流通領(lǐng)域畜禽肉制品中松香殘留水平、規(guī)范畜禽屠宰加工具有重要意義。

AA和DHA廣泛存在于造紙廠的廢水中[12]，在日用消費品，如藥劑[13]、化妝品[14]等中也常有檢出，甚至可以通過包裝材料遷移進入食品中[15]。AA和DHA的檢測方法主要有氣相色譜法(GC)[16-17]、高效液相色譜法(HPLC)[2,13,18-20]以及液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)[21-22]。相對而言，基于HPLC的分析方法應(yīng)用更為普遍。針對畜禽肉制品中存在的松香殘留，國內(nèi)學(xué)者也已建立了基于HPLC的分析方法，并對流通領(lǐng)域內(nèi)的白條鴨、豬頭(爪)及其熟制品中的AA和DHA進行了調(diào)查，結(jié)果表明生熟畜禽肉制品，尤其是水禽肉制品中松香殘留的檢出陽性率以及含量確實值得關(guān)注[10-11,23-25]。

酶聯(lián)免疫吸附分析(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)技術(shù)具有簡便、快捷、通量高等優(yōu)點，廣泛應(yīng)用于化學(xué)污染物的快速分析中。松香主要成分AA和DHA都是小分子化學(xué)物質(zhì)，不具備免疫原性，目前國內(nèi)外均未見松香殘留的人工抗原合成、多克隆抗體制備以及相關(guān)ELISA的研究報道。本文以脫氫松香胺(dehydrobietylamine，DHAM)半抗原，通過琥珀酸酐(succinic anhydride，SUC)?；蠓謩e與牛血清蛋白(bull serum albumin, BSA)和鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet haemocyanin, KLH)偶聯(lián)，合成、表征了人工抗原(合成路線見圖1)。在此基礎(chǔ)上通過免疫新西蘭大白兔制備了多克隆抗體，希望為進一步建立畜禽加工肉制品中松香殘留的ELISA方法打下基礎(chǔ)。

圖1 以DHAM為原料合成抗原的示意圖Fig.1 Scheme for synthesis of antigens from DHAM

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫氫松香胺、脫氫松香酸、松香酸、琥珀酸酐、牛血清蛋白、鑰孔血藍蛋白購自北京百靈威科技有限公司；弗氏完全佐劑購自美國Sigma公司；HRP羊抗兔IgG購自南京巴傲得生物科技有限公司；其余化學(xué)試劑均為分析純，實驗用水由美國Millipore公司純水儀制備。

新西蘭大白兔由江蘇省農(nóng)科院動物免疫工程研究所提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Nicolet iS50型傅立葉變換紅外光譜儀，美國Thermofisher公司；Avance 400型核磁共振波譜儀，瑞士Bruck公司；1260/6420A型高效液相色譜法串聯(lián)質(zhì)譜分析儀，美國Agilent公司；LS55型熒光分光光度儀，美國PerkinElmer公司；Epoch型微孔板分光光度儀,美國Bioteck公司；UV1100型紫外可見分光光度計，上海美普達公司。

1.3 實驗方法

1.3.1DHAM-SUC的合成

DHAM(285 mg，1.0 mmol)和SUC(120 mg，1.2 mmol)溶于10 mL無水吡啶，在室溫下攪拌24 h。反應(yīng)混合物中加入20 mL水，然后用50 mL乙酸乙酯萃取2次。有機相用水洗并用硫酸鎂干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，粗產(chǎn)物用硅膠柱凈化，用乙酸乙酯-正己烷(V/V=3∶2，φ=0.1%的乙酸)洗脫，洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)獲得灰白色琥珀酰脫氫松香胺(DHAM-SUC)，用紅外光譜(IR)，核磁共振(1H NMR)以及質(zhì)譜(ESI-MS)進行表征。

1.3.2DHAM-SUC-BSA和DHAM-SUC-KLH的合成

DHAM-SUC(38.5 mg，0.10 mmol)溶于10 mL無水二惡烷，然后加入三丁胺(28.5 μL，0.12 mmol)和氯甲酸叔丁酯(16.4 μL，0.12 mmol)，室溫下攪拌1 h。反應(yīng)混合物滴加入BSA(660 mg，0.01 mmol)的Tris緩沖溶液(20 mL，pH=8.8)，4 ℃條件下攪拌過夜。將制得的半抗原-蛋白偶聯(lián)物溶液轉(zhuǎn)移至透析袋，在超純水中透析24 h，期間更換4次超純水(2 L)。透析的溶液凍干獲得白色泡沫狀DHAM-SUC-BSA(516 mg)。

同法合成DHAM-SUC-KLH，其中KLH用量為80 mg(2×10-5mmol)。

用熒光光譜表征DHAM-SUC-BSA和DHAM-SUC-KLH。

1.3.3DHAM-SUC-BSA和DHAM-SUC-KLH偶聯(lián)比的測定

完全抗原偶聯(lián)比的測定參考文獻[26]，并略做修改，簡述如下：以L-纈氨酸作為活性氨基的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用ω=4%的Na2CO3水溶液配制系列L-纈氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后與ω=0.1%的三硝基苯磺酸(TNBS)溶液混勻，40 ℃恒溫水浴避光反應(yīng)2 h，于420 nm處測定吸光值(OD420)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；分別稱取適量的載體蛋白和完全抗原，操作同上。按式(1)計算完全抗原偶聯(lián)比。

人工抗原偶聯(lián)比=(CA/m1-CB/m2)×V×M×10-6，

(1)

其中，CA、CB分別為載體蛋白和完全抗原溶液的活性氨基，μmol/L；m1、m2分別為載體蛋白和完全抗原的稱樣質(zhì)量，mg；V為溶解載體蛋白和人工抗原的溶液體積，mL；M為載體蛋白的分子量，KLH為4.0×105Da，BSA為6.6×104Da。

1.3.4免疫實驗

新西蘭大白兔5只，其中4只皮下注射2.0 mL的DHAM-SUC-KLH(1.75 mg溶于1.0 mL含有0.25 mL DMSO的PBS，然后用1.25 mL弗氏完全佐劑乳化)，另一只用KLH代替DHAM-SUC-KLH進行免疫，作為陰性對照。在第21、38和50天，每只新西蘭大白兔采血10 mL觀察抗體產(chǎn)生情況。每次采血同時，肌肉注射1.0 mL的DHAM-SUC-KLH(1.0 mg溶于0.5 mL含有0.25 mL DMSO的PBS，然后用0.75 mL弗氏完全佐劑乳化)?？寡宓味炔捎瞄g接ELISA測定，其中DHAM-SUC-BSA用作包被抗原。最后一次注射后7 d，每只新西蘭大白兔心臟采血，離心去除細胞后收集抗血清，-80 ℃保存。

1.3.5間接ELISA測定抗血清效價

新西蘭大白兔最后一次免疫7 d后采血測定其抗血清效價，方法如下。以2 μg/mL的抗原(DHAM-SUC-BSA)包被96孔酶標(biāo)板(包被液為pH值9.6的0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液)，每孔100 μL，4 ℃過夜，用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST，pH值7.4)洗板3次；以w=5%脫脂乳(溶于PBST)進行封閉，每孔100 μL，37 ℃放置1 h，PBST洗板3次；加入倍比稀釋的待檢血清(采用w=2%脫脂乳稀釋)，每孔100 μL，37 ℃放置 1 h，洗板3次；加入一定稀釋度的HRP羊抗兔IgG(采用w=2%脫脂乳稀釋)，每孔100 μL，37 ℃ 放置1 h，PBST洗板3次；加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液，每孔100 μL，37 ℃顯色5 min；每孔加入2 mol/L H2SO450 μL，終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀測定OD450值。

以S/N≥2.1所對應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)為陽性血清的抗體效價，其中S為陽性血清的OD450，N為陰性血清的OD450。

1.3.6抗血清與DHA和AA反應(yīng)靈敏度的初步評價

采用間接競爭ELISA評價抗血清與DHA和AA反應(yīng)靈敏度，方法如下。根據(jù)1.3.5節(jié)的結(jié)果，將OD450在1.0左右的抗體稀釋倍數(shù)作為抗血清的稀釋倍數(shù)，添加系列DHA或AA標(biāo)準(zhǔn)溶液(1～500 μg/L)，參照1.3.5節(jié)測定OD450，按式(2)計算抑制率。

抑制率=[(A0-A)/A0]×100%，

(2)

其中A為DHA或AA標(biāo)準(zhǔn)溶液(1～500 μg/L)的吸光值，A0為未添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度對數(shù)值為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，建立回歸方程，分別計算DHA和AA的50%抑制濃度(IC50)和20%抑制濃度(IC20)。

2 結(jié)果與討論

2.1 DHAM-SUC的鑒定結(jié)果

圖2 半抗原DHAM-SUC的紅外光譜Fig.2 IR spectrum of DHAM-SUC

以上結(jié)果證明DHAM和SUC的?；磻?yīng)獲得成功。

圖3 半抗原DHAM-SUC的1H NMR圖Fig.3 1H NMR spectrum of DHAM-SUC

圖4 半抗原DHAM-SUC的質(zhì)譜Fig.4 ESI mass spectrum of DHAM-SUC

2.2 完全抗原的鑒定結(jié)果

為了觀察DHAM-SUC和BSA、KLH的偶聯(lián)，本文比較了偶聯(lián)前后BSA、KLH的熒光光譜(圖5和圖6)。完全抗原DHAM-SUC-BSA和DHAM-SUC-KLH的熒光強度均顯著低于相同蛋白濃度的BSA和KLH。半抗原DHAM-SUC通過羧基與BSA和KLH上的游離伯氨基發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白上的游離胺基數(shù)減少，導(dǎo)致偶聯(lián)蛋白的熒光強度下降，但幾乎不改變其最大發(fā)射波長[27]。蛋白偶聯(lián)前后的熒光光譜表明，半抗原已與BSA和KLH成功偶聯(lián)。

蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度：BSA及完全抗原濃度均為20 μg/mL；激發(fā)波長225 nm；掃描250～450 nm。圖5 BSA和DHAM-SUC-BSA的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of BSA and DHAM-SUC-BSA

蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度：KLH及完全抗原濃度均為0.2 mg/mL；激發(fā)波長225 nm；掃描250～450 nm。圖6 KLH和DHAM-SUC-KLH的熒光光譜Fig.6 Fluorescence spectra of KLH and DHAM-SUC-KLH

運用三硝基苯磺酸法測定偶聯(lián)前后蛋白的游離氨基數(shù)，計算偶聯(lián)比，結(jié)果顯示DHAM-SUC-BSA和DHAM-SUC-KLH的偶聯(lián)比分別為12和35。

2.3 抗體的效價分析

最后一次免疫7 d后，4號新西蘭大白兔抗血清的效價達到了1.28×105，其余也達到了6.4×104。表明本文制備的完全抗原具有良好的免疫原性。

2.4 抗體與脫氫松香酸和松香酸反應(yīng)的靈敏度分析

為了初步了解抗血清對松香主要成分DHA和AA的靈敏度，本文在固定包被抗原濃度(2 μg/mL)和抗血清稀釋倍數(shù)(3.2×104)的條件下，利用4號新西蘭大白兔的抗血清分別觀察了DHA和AA的抑制率和濃度對數(shù)的關(guān)系(見圖7)。其中DHA的回歸方程為y=32.23x+4.85(R2=0.993 9)，IC50為25.1 μg/L，IC20為3.0 μg/L；AA的回歸方程為y=3.49x+2.45(R2=0.994 9)，IC50為36.4 μg/L，IC20為5.4 μg/L。以IC20作為檢測限和常見的儀器分析方法比較，4號新西蘭大白兔的抗血清對DAH和AA的靈敏度已顯著優(yōu)于基于GC[16-17]和HPLC[18-20]的方法，與LC-MS分析方法[21-22]相當(dāng)。

圖7 間接競爭ELISA 測得的DHA和AA的抑制曲線Fig.7 Inhibition curves for DHA and AA using indirect competitive ELISA

松香的主要成分AA和DHA，不具備免疫原性。本文曾利用亞硫酰氯法將DHA直接與BSA和KLH偶聯(lián)，成功合成并表征了DHA-BSA以及DHA-KLH(數(shù)據(jù)未列出)，并將DHA-KLH作為免疫抗原對兔子進行了免疫，但是未能成功獲得高效價的抗血清。我們認為DHA-KLH可能在兔子體內(nèi)發(fā)生了分解，失去了免疫原性。

DHAM雖然不是松香的成分，但與松香的主要成分DHA和AA的化學(xué)結(jié)構(gòu)高度相似。本文利用DHAM上的伯氨基可以在溫和條件下與羧基形成酰胺的特點，將DHAM經(jīng)過琥珀酸與載體蛋白偶聯(lián)。運用DHAM-SUC-KLH作為免疫原、免疫新西蘭大白兔產(chǎn)生了具有理想效價的抗血清。免疫獲得的抗血清對松香主要成分DHA和AA均具有理想的靈敏度，為下一步建立畜禽肉制品中松香殘留ELISA方法的建立打下了堅實的基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

本文利用DHAM為半抗原、經(jīng)過琥珀?；cBSA和KLH偶聯(lián)，成功合成了松香的完全抗原DHAM-SUC-BSA和DHAM-SUC-KLH，并以DHAM-SUC-KLH為免疫原對家兔進行了免疫，獲得了抗血清，效價達1.28×105。運用間接競爭ELISA，對DHA、AA的抑制率進行了初步研究，IC50分別為25.1 μg/L和36.4 μg/L。

本文的創(chuàng)新點是以DHAM半抗原合成松香人工抗原，并制備多克隆抗體，為進一步建立畜禽肉制品中松香殘留的ELISA分析方法打下了基礎(chǔ)。