鋼鵝mtDNA全序列的克隆和生物信息學(xué)分析

吳啟超，謝艾軒，劉賀賀，李 亮，宋 浪，許恒勇，白麗麗

(1四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，四川 成都 611130；2西昌華農(nóng)禽業(yè)有限公司，四川 西昌 615000)

線粒體DNA(mtDNA)為母性遺傳，不遵守孟德爾遺傳定律，具有可溯源性，且突變率適中，這些特點使其成為從分子水平研究物種遺傳結(jié)構(gòu)和起源進化的重要遺傳標(biāo)記[1-2]。隨著對動物線粒體研究的深入，到目前為止GenBank公布的鳥類線粒體已經(jīng)有640條[3]。與核基因組相比，線粒體全基因組的進化速率較快，且不同區(qū)域的進化速率存在差異[4]。首先mtDNA控制區(qū)擁有眾多的多變位點，其堿基的突變不受選擇的影響，是其他區(qū)域進化速度的3～5倍，包含更豐富的信息資源，因此該區(qū)域是最有研究價值的區(qū)域[5]。進化速度次之的是mtDNA蛋白質(zhì)編碼基因，最慢的是mtDNA的tRNA和rRNA基因，且rRNA基因是所有基因中進化最慢、最保守的基因[6]。對于鵝線粒體基因的研究起步較晚，相關(guān)研究主要集中在mtDNA部分基因和特定區(qū)域上。李建華[7]測定了6個家鵝品種的ND4基因序列，發(fā)現(xiàn)家鵝群體的遺傳分化主要是由鴻雁家鵝和灰雁家鵝品種間的遺傳分化造成的；陳艷榮等[8]、劉安芳等[9]分別測定了多種中國家鵝和歐洲家鵝的tRNA和細胞色素B基因，結(jié)果支持鵝的2個不同起源學(xué)說即中國家鵝來自于鴻雁，歐洲家鵝則來自灰雁；郭軍等[10]擴增獲得了太湖鵝和朗德鵝線粒體ND4基因序列，并結(jié)合GenBank中11種鳥類線粒體的同源序列，分別采用最大簡約法和最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，得出了白額雁與中國鵝在遺傳距離上更近，中國鵝與歐洲鵝在19萬年前開始分化的結(jié)論； 張湯杰等[11]擴增了26個國內(nèi)地方品種鵝mtDNA的部分D-loop區(qū)序列，其中包括鋼鵝的D-loop區(qū)序列，從分子水平上證明伊犁鵝起源于灰雁，而其他26個地方品種鵝起源于鴻雁。目前，基于鵝mtDNA全序列開展的相關(guān)研究還較少，郝家勝等[12]對5個品種中國鵝、鴻雁及朗德鵝的mtDNA限制性片段進行了多態(tài)性分析，證實了中國鵝起源于鴻雁的推測，同時也得出了朗德鵝與中國鵝起源于不同祖先的結(jié)論。Lin等[13]測定了鄢陵白鵝和武岡銅鵝的mtDNA全序列，為湖南鵝的遺傳進化研究提供了重要數(shù)據(jù)，同時也為揭示家禽的遺傳機制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

鋼鵝在分類學(xué)上隸屬于鳥綱雁形目(Anseriform)鴨科(Anatidae)雁屬，廣泛分布于四川涼山安寧河流域。鋼鵝屬中大型鵝種，其背羽、翼羽、尾羽為棕色或白色鑲邊的灰黑色羽，狀似鎧甲，又被稱為鐵甲鵝，已被列入《中國畜禽遺傳資源志·家禽志》[14]。與其他鵝類相比，鋼鵝具有產(chǎn)肉性能好、肉質(zhì)光澤細嫩、肉蛋白質(zhì)含量高、脂肪沉積能力強、耐粗飼及抗病力強等諸多優(yōu)點。近年來，鋼鵝品種資源處于瀕臨滅絕的狀態(tài)，然而對鋼鵝分子遺傳的研究尚較為鮮見，也未見關(guān)于鋼鵝mtDNA全序列的報道，這對于鋼鵝品種的保護十分不利。為此，本研究對鋼鵝mtDNA全序列進行了測定，并對mtDNA序列的結(jié)構(gòu)和組成進行分析，以期為鋼鵝品種保護和豐富鳥類mtDNA數(shù)據(jù)資料提供支持。

1 材料與方法

1.1 鋼鵝材料

鋼鵝血樣采自四川省西昌市國家鋼鵝保種場，采集后立刻置于-20 ℃冰箱保存，用于后期核酸的提取。將從6個不同個體中采取的6 管血樣平均分成了2組，其中一組用于測序，另一組用于驗證試驗，以確保試驗結(jié)果的準確性。

1.2 試驗方法

1.2.1 總DNA提取 按照DNA提取試劑盒DP318-02(天根生化科技有限公司，中國北京)操作步驟提取鋼鵝血樣基因組DNA，無水乙醇沉淀，自然晾干，TE溶解后，用NanoDrop濃度儀測定DNA純度，并用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，結(jié)果表明總DNA完整，其A260/A280值均在1.60～1.80，符合純度要求。將提取到的純度符合要求的DNA置-20 ℃冰箱保存。

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中Chinese Goose線粒體基因組序列(登錄號：KJ124555)，用Primer 5.0[15]軟件設(shè)計并確定18 對引物(表1)，引物由華大生物科技有限公司合成。

1.2.3 PCR 擴增與測序 PCR擴增體系10 μL：總DNA模板(50 mg/L)1 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,PremixTaq(TaKaRa Biotechnology)5 μL，加純水補足10 μL。擴增反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火(溫度見表1)45 s左右(產(chǎn)物長度408 bp 18 s，714 bp 32 s，900～1 100 bp 45 s，1 100～1 300 bp 54 s，1 300～1 500 bp 63 s，1 656 bp 75 s)，72 ℃延伸2 min，36個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，12 ℃保溫。

表1 供試18對擴增引物及其序列等信息Table 1 Information of 18 pairs of primers used in this study

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，使用膠回收純化試劑盒(TaKaRa Biotechnology 9762)對目的條帶進行回收并分離純化。對純化后的PCR產(chǎn)物進行克隆，連接PMD19-T載體(TaKaRa Biotechnology)，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α(Solarbio)中培養(yǎng)，挑取陽性克隆送成都擎科生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。

1.2.4 序列分析軟件 測序結(jié)果使用DNAstar[16]軟件進行校對和拼接，并用DNAstar統(tǒng)計序列全長、密碼子使用情況及堿基含量。參考NCBI上已公布的雁形目mtDNA序列信息，并利用ORFfinder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)及tRNAscan-SE Search Server 1.21(http://lowelab.ucsc.edu/tRNAscan-SE/)在線軟件對鋼鵝線粒體基因組全序列進行基因定位和注釋[17]。利用RNA structure 5.6分析tRNA，并預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)[18]。利用ClustalX 1.8對鋼鵝與其他鵝的mtDNA進行序列比對[19]，用CGView(http://stothard.afns.ualberta.ca/cgview_server/)繪制線粒體全序列注釋圖，并利用MEGA 6.0構(gòu)建進化樹[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鋼鵝mtDNA全序列分析

用SepMan將18段擴增片段拼接校正后，得到鋼鵝完整的mtDNA序列，全長為16 739 bp，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。鋼鵝mtDNA序列和其他雁形目類似，由一個非編碼區(qū)(即D-loop區(qū))和編碼區(qū)組成，其中編碼區(qū)由2個rRNA基因(12S rRNA和16S rRNA)、13個蛋白質(zhì)編碼基因和22個tRNA基因組成。由表2可知，鋼鵝線粒體中A、T、C和G堿基含量分別為30.18%，22.54%，32.18%和15.10%，無明顯的AT偏好，這與其他雁形目鳥類相似(表2)。

鋼鵝線粒體基因組結(jié)構(gòu)如表3所示。由表3可知，鋼鵝mtDNA蛋白質(zhì)編碼區(qū)中含有13個起始密碼子和11個終止密碼子，起始密碼子有CTA、ATN(N為不確定堿基，下同)和GTN 3種，除了ND6的起始密碼子是CTA外，其余都是標(biāo)準的ATN和GTN；終止密碼子有CAG、TAN、AGN和不完全的T 4種。CO3和ND4的終止密碼子為不完全的T，經(jīng)轉(zhuǎn)錄后多聚腺苷酸化可形成完整的終止密碼子TAA[21]。COX1、ND3和ND5的終止密碼子為標(biāo)準的AGN，ND6的終止密碼子是CAG，其余基因的終止密碼子均為標(biāo)準的TAN。鋼鵝mtDNA編碼區(qū)中無內(nèi)含子和轉(zhuǎn)座子，而是存在一些基因重疊和間隔現(xiàn)象。另外，蛋白質(zhì)編碼基因中除了ND6以外，其余蛋白質(zhì)編碼基因均位于L鏈；而22個tRNA中除了tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser、tRNA-Glu和tRNA-Pro在L鏈編碼外，其余的基因均編碼于H鏈。

圖1 鋼鵝線粒體基因組(16 739 bp)結(jié)構(gòu)注釋圖譜Fig.1 Mitochondrial genome annotation map of Gang goose(16 739 bp)

表2 雁形目鳥類線粒體核苷酸組成Table 2 Nucleotide composition of Anseriform mitochondrial genomes

表3 鋼鵝線粒體基因組結(jié)構(gòu)分析Table 3 Structure of the Gang goose’s mitochondrial genomes

表3(續(xù)) Continued table 3

注：“*”表示由輕鏈(L)編碼,“△”表示密碼子不確定，“-”表示數(shù)據(jù)不存在。

Note:“*”.Coded on complement(L)strand.“△”.Codon is uncertain.“-”.Data not exist.

2.2 鋼鵝線粒體tRNA和rRNA分析

鋼鵝線粒體基因組中含有22個tRNA，均為4個恒定臂的三葉草二級結(jié)構(gòu)，長度為66～76 bp，其中有2個tRNA-Ser和tRNA-Leu。分析22個tRNA 結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)其DHU臂的長度為3～4 bp，反密碼子臂長度為3～5 bp，TΨC臂長度為4～5 bp，氨基酸接受臂和反密碼子環(huán)長度為7 bp。在22個tRNA臂上共發(fā)現(xiàn)4處AC錯配(圖2-A)、1處UU錯配(圖2-B)、1處AA錯配(圖2-C)、21處GU錯配(圖2-D)和3處CU(圖2-B)錯配。由于這些錯配堿基周圍存在GC堿基配對現(xiàn)象，GC之間能夠形成3個氫鍵，所以能在一定程度上穩(wěn)定部分錯配堿基造成的不穩(wěn)定狀態(tài)。

rRNA是mtDNA中最為保守、進化最慢的基因。鋼鵝mtDNA中含有12S rRNA和16S rRNA 2種rRNA，長度分別為987和1 610 bp, 12S rRNA位于tRNA-Phe與tRNA-Val之間, 16S rRNA位于tRNA-Val與tRNA-Leu(UUR)之間。

2.3 鋼鵝mtDNA的D-loop區(qū)序列分析

鋼鵝線粒體D-loop區(qū)位于tRNA-Glu與tRNA-Phe之間，總長1 176 bp。預(yù)測結(jié)果(圖3)表明，D-loop區(qū)含有的保守框分別是LSP/HSP、ETAS1-2、Goose hairpin、E-box、F-box、D-box、C-box、CSB1-box和CSB-like。將鋼鵝mtDNA D-loop區(qū)序列與綠頭鴨、斑嘴鴨、紹興鴨和鴻雁4種雁形目物種D-loop區(qū)序列進行對比，結(jié)果(圖4)發(fā)現(xiàn)，鋼鵝mtDNA的D-loop區(qū)序列與鴻雁mtDNA的D-loop區(qū)序列差異極小，與綠頭鴨、嘴鴨和紹興鴨差距較大。

箭頭標(biāo)示錯配基因 The arrows show mismatch places圖2 鋼鵝部分tRNA二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.2 Prediction of tRNA secondary structure of Gang goose

圖3 鋼鵝mtDNA D-loop保守區(qū)預(yù)測Fig.3 Prediction of mtDNA D-loop region of Gang goose

“-”表示堿基缺失；“.”表示堿基相同 “-” mean the base deletion；“.” mean the base is the same圖4 鋼鵝與其他4種雁形目物種D-loop區(qū)序列的比較Fig.4 Comparison of D-loop sequences between Gang goose and four other species

2.4 鋼鵝mtDNA蛋白質(zhì)編碼基因分析

鋼鵝mtDNA中含有13個蛋白質(zhì)編碼基因，包括細胞素C氧化酶3個亞基基因COⅠ、COⅡ和COⅢ，細胞色素C還原酶亞基基因Cytb,ATP合成酶亞基基因ATPase6和ATPase8及NADH脫氫酶7個亞基的基因ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5和ND6。其中CO1、CO2和CO3最保守，與其他鵝種的同源性可達80%左右，而ATPase6、ATPase8和NADH脫氫酶7個亞基基因與其他鵝種的相關(guān)基因相比變異較大。ATPase6和ATPase8是調(diào)控能量合成的基因，其處于相鄰的位置，兩者存在6個堿基的重疊。ATPase6長度為681 bp，可以編碼226個氨基酸；ATPase8長度為165 bp，可以編碼54個氨基酸。在鋼鵝ND3基因的174位存在胞苷酸C，這種情況存在大多數(shù)的鳥類中，目前認為是不會被翻譯的[22]。細胞素氧化酶亞基基因CO1、CO2和CO3具有質(zhì)子泵的作用，可將H+由基質(zhì)抽提到膜間隙，同時可通過血紅素中鐵原子的氧化還原變化，將電子傳遞給還原的氧而生成水。CO1基因長度為1 548 bp，編碼515 個氨基酸；CO2基因長度為684 bp，可以編碼227個氨基酸；CO3基因長度為783 bp，編碼260個氨基酸，參與氧化還原連接的質(zhì)子易位過程[23]。Cytb基因緊密結(jié)合在線粒體內(nèi)膜上，長度為1 140 bp，包含1個終止密碼子TAA，編碼380個氨基酸。NADH還原酶亞基作為第一個質(zhì)子泵，將NADH上的2個高勢能電子轉(zhuǎn)移到其FMN輔基上，使NADH氧化[24]。 將鋼鵝ND6編碼的氨基酸與鴻雁、小天鵝、紹興鴨、建昌鴨的ND6編碼氨基酸進行比對，結(jié)果見圖5。圖5表明，鋼鵝與鴻雁ND6編碼的氨基酸相同，但與其他鵝種差異較大，這種差異可能與鋼鵝的能量代謝有關(guān)。

圖5 鋼鵝與其他5種鵝種ND6編碼氨基酸序列的比對結(jié)果Fig.5 Comparison of ND6 amino acids between Gang goose and other 5 species

2.5 基于mtDNA的部分禽類進化樹分析

為了確定鋼鵝與其他鳥類品種親緣關(guān)系的遠近，從NCBI上下載了相關(guān)序列，用 ClustalX 1.8對D-loop區(qū)序列和mtDNA全序列進行比對，在MEGA 6.0中使用最大似然法建立系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖6。

圖6 基于mtDNA全序列(A)和D-loop 區(qū)(B)構(gòu)建的雁型目系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree construction based on mtDNA and D-loop region sequences

基于mtDNA全序列的比對分析結(jié)果(圖6-A)表明，鋼鵝和鴻雁親緣關(guān)系最為接近，二者首先處于同一分支，然后與灰雁聚為一支，再與白額雁、小天鵝相聚;鵲雁與小白鷺處于同一分支，此分支又與紅原雞及前一大支相聚。發(fā)育樹還顯示出斑嘴鴨與綠頭鴨親緣關(guān)系較近，并與紹興鴨、建昌鴨依次相接形成一群。從基于D-loop區(qū)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6-B)可見，鋼鵝和鴻雁聚成一個分支，二者親緣關(guān)系較近，再與斑嘴鴨相聚后，與綠頭鴨聚成一支，最后與紹興鴨并為一群。

3 討 論

本研究設(shè)計了18對引物并利用DNA測序技術(shù)成功獲得了鋼鵝mtDNA序列，其全長為16 739 bp，在擴增后又進行了3次驗證試驗，確保了擴增序列的準確性及后續(xù)試驗分析結(jié)果的可靠性。

本研究發(fā)現(xiàn)，鋼鵝線粒體中A、T、C和G堿基含量分別為30.18%，22.54%，32.18%和15.10%，堿基G的含量偏低，這是線粒體基因組的一個特征[18]。mtDNA編碼區(qū)中無內(nèi)含子和轉(zhuǎn)座子，但卻存在一些基因重疊和間隔現(xiàn)象。在鋼鵝ND3基因的174位存在胞苷酸C，這種情況存在于大多數(shù)的鳥類中，目前認為是不會被翻譯的[22]。

鋼鵝與其他雁形目鳥類品種的ND6編碼氨基酸存在一定差異。鋼鵝是涼山地方鵝種，主要分布于涼山安寧河流域海拔氣候差異不大的壩區(qū)鄉(xiāng)鎮(zhèn)，導(dǎo)致能量代謝與其他地域有所差異。鋼鵝的ND6編碼氨基酸與鴻雁相同，但與小天鵝、紹興鴨、綠頭鴨和建昌鴨差異較大，這種差異可能與鋼鵝的能量代謝有關(guān)。鋼鵝是產(chǎn)肥肝性能優(yōu)異的地方良種，線粒體ND6基因上的差異是否與鋼鵝肝臟脂肪沉積能力有關(guān)，還需要進一步研究。

mtDNA的D-loop區(qū)受選擇壓力較小，進化速度較快[11]，其堿基替換率是mtDNA其他基因區(qū)的2.8～5.0倍[25]。分析鋼鵝D-loop區(qū)序列，發(fā)現(xiàn)其中含有LSP/HSP、ETAS1-2、Goose hairpin、E-box、F-box、D-box、C-box、CSB1-box、CSB-like保守框，具有鳥類的一般特征。為了研究鋼鵝的系統(tǒng)進化情況，從NCBI下載了相關(guān)的序列，用ClustalX 1.8進行D-loop區(qū)序列和mtDNA序列比對，基于mt-DNA全序列和D-loop區(qū)序列的比對結(jié)果均表明，鋼鵝與鴻雁、灰雁血緣關(guān)系較近，這一結(jié)果也進一步證明中國鵝起源于鴻雁和灰雁。