殼聚糖的定向修飾及其衍生物性能研究

易 喻，代茹楠，張彥璐，陳建澍，應(yīng)國清*

（浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310014）

天然殼聚糖是一種高分子量的直鏈多糖，由β-（1-4）-2-乙酰胺基-2-乙酰胺基-2-脫氧-β-D-葡萄糖和 β-（1-4）-2-氨基-2-乙酰胺基-2-脫氧-β-D-葡萄糖交替結(jié)合而成，在自然界中非常豐富，是昆蟲和甲殼類動物外骨骼的組成成分[1]。殼聚糖無毒害[2]，擁有良好的生物降解能力[3]，生物相容性[4]，無抗原性[5]，抑菌性[6]和促進傷口愈合的能力[7-8]。殼聚糖在農(nóng)業(yè)、環(huán)境保護、制藥、醫(yī)學(xué)以及食品工業(yè)上都有廣泛的應(yīng)用[9-10]。然而由于殼聚糖只能溶于pH=6.5以下的酸性水溶液中 （如甲酸、乙酸、丙酸、乳酸、檸檬酸等）[11]，因此相關(guān)的應(yīng)用受到了很大的限制。殼聚糖本身的剛性結(jié)構(gòu)和分子內(nèi)強烈的氫鍵作用是導(dǎo)致其水溶性差的主要原因，改善殼聚糖的水溶性通常有三種途徑：①控制殼聚糖的脫乙酰度[12-13]，對高脫乙酰度高的殼聚糖進行?；磻?yīng)，破壞殼聚糖原有致密晶體結(jié)構(gòu)，使其脫乙酰度（DD）控制在50%左右；②將殼聚糖在適當條件下降解為低分子量（<5000 D）的水溶產(chǎn)物[14]。③ 利用殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中的羥基和氨基的反應(yīng)活性，在其分子鏈上引入親水基團，并破壞分子內(nèi)的氫鍵作用。?；痆15]、季胺化[16]、羧甲基化[17]均能削弱分子內(nèi)氫鍵從而增加了殼聚糖的水溶性。已有的研究和實踐已獲得一些階段性的結(jié)果[18-20]，但還有些問題值得進一步研究，如-OH和-NH2，哪個是改善水溶性的關(guān)鍵等。

因此，本論文利用不同的反應(yīng)原理定向在殼聚糖的-OH或者-NH2上修飾上同樣的疏水基團苯甲酰基），表征后研究N-苯甲酰殼聚糖和O-苯甲酰殼聚糖之間的溶解性的差異，分析差異產(chǎn)生的原因。

1 材料與方法

1.1 材料

殼聚糖（DD ≥ 90%，MW=205 kD）（浙江澳興生物技術(shù)有限公司）、苯甲酰氯（上海生物化工有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 N-苯甲酰殼聚糖的制備

在室溫下，將1.0 g殼聚糖溶于45 mL 0.2 mol/L的HCl水溶液，然后加入15 mL丙酮，攪拌15 min，向上述溶液加入2 mL吡啶，繼續(xù)攪拌15 min。將2.0 e.q.-NH2的苯甲酰氯溶于15 mL丙酮，用恒壓滴定漏斗緩慢滴加到殼聚糖的HCl/丙酮/吡啶混合溶液中，50℃攪拌反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后將溶液傾倒入400 mL丙酮中得到沉淀，抽濾得到固體，固體再用丙酮和無水乙醇洗滌3～5次，加30 mL水溶解后放入透析袋中透析3～5 d，凍干后得到N-苯甲酰殼聚糖。

圖1 N-苯甲酰殼聚糖1的合成路線

1.2.2 O-苯甲酰殼聚糖的制備

在室溫下，1.0 g殼聚糖溶于15 mL甲磺酸中，攪拌15 min至完全溶解，之后將上述溶液放置于0℃冰浴，待溶液的溫度達到冰浴溫度后，向反應(yīng)液中一邊攪拌一邊緩慢滴加苯甲酰氯，手工攪拌1 h后于室溫下攪拌反應(yīng)3 h，最后放置于-20℃冰箱過夜。次日取出反應(yīng)液，放于室溫使之融解，立即與200 mL冰水混合，抽濾取沉淀，沉淀用30 mL水溶解后用2 mol/L的NaOH溶液中和至中性，用丙酮沉淀后取沉淀，用無水乙醇和丙酮洗3～5次后溶于30 mL純水，加入透析袋透析3～5 d，之后凍干得到O-苯甲酰殼聚糖。

圖2 O-苯甲酰殼聚糖2的合成路線

1.2.3 殼聚糖脫乙酰度測定

根據(jù)文獻[21]的酸堿滴定法，準確稱量0.20 g烘干到恒重的殼聚糖及其衍生物樣品，溶于20.00 mL 0.1 mol/L經(jīng)標定的鹽酸溶液中，加入甲基橙和苯胺藍的混合指示劑，用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液滴定，溶液顏色從紫紅變藍綠色。每個樣品的脫乙酰度測定三次，取平均值為樣品的脫乙酰度。

1.2.4 殼聚糖衍生物取代度的測定

（a）N-糖基化殼聚糖的氨基取代度可由以下公式計算：

（b）通過1H NMR對殼聚糖骨架C2-C6上H以及取代基上的H進行積分，根據(jù)以下公式計算得到N-或O-取代殼聚糖衍生物的修飾率：

式中：n為取代基上的H的個數(shù)。

1.2.5 殼聚糖衍生物溶解度的測定

參照文獻[22]的方法，精確稱取0.05 g殼聚糖衍生物，加入5 mL去離子水，機械攪拌3 h，然后用0.45μm孔徑的微孔濾膜過濾，未通過濾膜的物質(zhì)干重設(shè)為m1，則這種衍生物的溶解度 =（0.05-m1）/5×100，單位為 g/100 mL。

1.2.6 表征

（1）FTIR 光譜

將樣品研碎后與KBr粉末混合壓片，在紅外光譜儀上進行測定，找出相關(guān)基團的特征吸收峰。

（2）核磁共振 NMR

樣品溶于D2O或者D2O和DCl的混合溶劑，作1H NMR。

2 結(jié)果與討論

2.1 FTIR光譜

圖 3（a）為殼聚糖原料的紅外譜圖，圖中593 cm-1為O-H面外彎曲，665 cm-1為N-H面外彎曲，1083 cm-1為C-OH的伸縮振動吸收峰，1384 cm-1處為CH3的對稱變形振動 （酰胺III帶），1597 cm-1處為氨基N-H的變形振動峰，2873 cm-1為C-H伸縮振動峰，3264cm-1為N-H伸縮振動吸收峰，3425 cm-1為O-H的伸縮振動吸收峰。

圖3（b）為N-苯甲酰殼聚糖的紅外譜圖，新出現(xiàn)在1633 cm-1處的吸收為二級酰胺 （酰胺I帶）C=O的伸縮振動，出現(xiàn)在1533 cm-1處的吸收為苯環(huán)的骨架振動吸收峰，3264 cm-1處的吸收減弱說明了苯甲酰化發(fā)生在C2-NH2上；1083 cm-1處的吸收峰幾乎沒有變化，說明殼聚糖的-OH不參加反應(yīng)。

圖3（c）為O-苯甲酰殼聚糖的紅外譜圖，從上至下分別為投料比（殼聚糖：苯甲酰氯）為1：1，1∶2和1∶4的產(chǎn)物。從圖上可以看出：

（1）當投料比為1∶1時，能夠說明殼聚糖C2-NH2發(fā)生?；磻?yīng)的吸收峰變化為：1637 cm-1處的新吸收峰為二級酰胺（酰胺I帶）C=O的伸縮振動說明有酰胺鍵生成，1597 cm-1處的吸收減弱說明C2的-NH仍在，3264 cm-1處的吸收減弱頁說明C2-NH2上也發(fā)生了苯甲?；徽f明殼聚糖-OH發(fā)生?；磻?yīng)的吸收峰變化為：1715 cm-1處出現(xiàn)的C=O伸縮振動吸收峰說明-OH發(fā)生?；酋；潭炔桓?，1083 cm-1處C-OH的伸縮振動吸收峰遷移至1049 cm-1也說明了這點。說明苯環(huán)存在的變化為：新的苯環(huán)特征吸收峰716 cm-1出現(xiàn)。

（2） 當投料比為 1∶2時，1720 cm-1處 C=O伸縮吸收變得更強，苯環(huán)吸收峰716 cm-1也變強，出現(xiàn)新的苯環(huán)伸縮振動峰1601 cm-1和684 cm-1，這些都說明DS較投料比1∶1時有所上升。

（3）當投料比為1∶4時，圖形和投料比1∶2時類似，1548 cm-1處酰胺II帶吸收加強，說明C2-NH2進一步參與反應(yīng)，DS在進一步增加。

（4） 當投料比為 1∶6 時，1720 cm-1處 C=O伸縮吸收進一步加強，3062 cm-1處的苯環(huán)C-H伸縮振動繼續(xù)變強。

2.2 1H NMR核磁分析

如圖4所示，1為N-苯甲酰殼聚糖的氫譜（D2O），2為O-苯甲酰殼聚糖的氫譜，且自上往下依次為投料比 （殼聚糖： 苯甲酰氯）1∶1（D2O&CF3COOD），1 ∶2（DMSO），1 ∶4（DMSO）和1∶6（DMSO）的產(chǎn)物的氫譜。

N-苯甲酰殼聚糖：δ=1.9為乙?；募谆?個 H，δ=2.75為殼聚糖骨架 C3上的 H，δ=3.53～3.80為殼聚糖骨架 C2，C4，C5和 C6上的 5個H，δ=4.86為殼聚糖骨架C1上的一個H，δ=7.34～7.52為苯環(huán)上C2-C4上的3個H，δ=7.67～7.74為苯環(huán)上C1和C5上的2個H。

O-苯甲酰殼聚糖：（1）1∶1∶δ=1.88為乙?；募谆?個H，δ=3.45～3.96為殼聚糖骨架C2，C4，C5和 C6上的 5個 H，δ=4.75為殼聚糖骨架 C1上的 H，δ=7.2為 N-H，δ=7.40～7.53為苯環(huán)上 C2-C4和 C2’-C4’上的 6個 H，δ=7.80～7.91 為苯環(huán)上 C1，C5，C1’和 C5’上 4 個 H；（2）1∶2～1∶6∶δ=3.00～4.20為殼聚糖骨架上的 7個H，δ=7.2為 N-H，δ=7.40～7.53為苯環(huán)上 C2-C4和 C2’-C4’上的 6個 H，δ=7.80～7.91為苯環(huán)上C1，C5，C1’和 C5’上 4 個 H。

通過積分計算可得物質(zhì)1的DS為0.52，21∶1的 DS為 0.43，21∶2的 DS為 0.53，21∶4的 DS為 0.75，21∶6的 DS為 1.08。

2.3 殼聚糖衍生物的溶解性

圖 3 殼聚糖 0（a），N-苯甲酰殼聚糖 1（b），O-苯甲酰殼聚糖 2（c）的 FTIR 譜圖

苯環(huán)是一種疏水性基團，微溶于水，溶于大多數(shù)有機溶劑。苯甲?；鶊F的引入能夠阻礙分子內(nèi)和分子間氫鍵的形成，從而改變殼聚糖衍生物的溶解性能。如表1所示，殼聚糖原料只溶于0.2 mol/L AcOH溶液，而DS＞0.44的N-苯甲酰殼聚糖開始表現(xiàn)出水溶性，DS為0.52的樣品溶于任何pH值的水溶液，苯環(huán)的作用更類似于一個“物理上的支架”，因此衍生物的溶解性不受pH值的影響，在純水中的溶解度可達10.7 g/L，配成25 g/L的濃度也能夠形成透明的凝膠狀物質(zhì)。所有的N-苯甲酰殼聚糖都不溶于0.5 mol/L NaOH、DMSO、CH3Cl、丙酮、DMF和乙醚，都溶于4.8%LiOH／8%尿素水溶液。N-苯甲酰殼聚糖的DS隨著反應(yīng)溫度和苯甲酰氯投料量的增加而上升，隨著相轉(zhuǎn)移催化劑吡啶的比例增加呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，原因是過量的吡啶會造成殼聚糖的析出，從而降低了DS。DS越高的樣品特性粘度越大，原因是苯環(huán)的接入會使得分子與分子之間的作用力變大，從而導(dǎo)致流動性變差。隨著DS的升高，特性粘度也會呈現(xiàn)下降的趨勢，這是因為接枝反應(yīng)導(dǎo)致分子鏈的斷裂從而使得分子量降低，特性粘度也相應(yīng)有所下降。

O-苯甲酰殼聚糖2的溶解性則較為復(fù)雜，2DS=0.43的樣品能夠部分溶于水和0.5 mol/L NaOH，溶于0.2 mol/L AcOH和4.8%LiOH/8%尿素水溶液，不溶于 DMSO、CH3Cl、丙酮、DMF 和乙醚，溶解后溶液呈淡黃色。2DS=0.53和2DS=0.75的樣品能夠部分溶于水、0.5 mol/L NaOH、CH3Cl和 DMF， 溶于0.2 mol/L AcOH、DMSO和4.8%LiOH/8%尿素水溶液，不溶于丙酮和乙醚，2DS=0.53溶解后溶液呈淡黃色，2DS=0.75溶解后溶液無色透明。2DS=1.08的樣品能夠部分溶于水、0.2 mol/L AcOH、0.5 mol/L NaOH、丙酮、氯仿和4.8%LiOH/8%尿素水溶液，溶于DMSO和DMF，溶解后溶液無色透明。 不難看出，隨著DS的上升O-苯甲酰殼聚糖的疏水性更強，能夠溶于更多的有機溶劑，而在水溶液中的溶解性開始下降。

圖4 N-苯甲酰殼聚糖1和O-苯甲酰殼聚糖2的1H NMR

表1 衍生物1和2的DS和溶解性

3 結(jié)論

本文通過定向修飾的方法獲得了兩種殼聚糖衍生物N-苯甲酰殼聚糖1和O-苯甲酰殼聚糖2，并對衍生物進行了FTIR、1H NMR表征，證實了這些衍生物的修飾成功。同時更進一步研究了接枝部位及DS對衍生物溶解性的影響，實驗結(jié)果表明：在-NH2上修飾疏水可以阻礙殼聚糖分子內(nèi)和分子間氫鍵的形成，增加殼聚糖的水溶性；在-OH上修飾疏水性基團還能增加殼聚糖的有機溶劑溶解性（O-苯甲酰殼聚糖），該研究為殼聚糖的定向修飾改性提供了一定參考價值。