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    一株深海來(lái)源放線菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物研究

    2018-12-06 13:21:06周廣敏
    浙江化工 2018年11期
    關(guān)鍵詞:分子式放線菌分子量

    王 鴻,周廣敏,華 熠

    (浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院,浙江 杭州 310014)

    海洋微生物因處于獨(dú)特的高壓、高鹽、低溫等環(huán)境造就了其與陸地微生物不同的代謝途徑[1],海洋來(lái)源的放線菌產(chǎn)生了許多具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物,包括抗菌、抗腫瘤、細(xì)胞毒性、免疫抑制劑等,生長(zhǎng)在未知或未開(kāi)發(fā)環(huán)境中的放線菌,包括研究較少的海洋環(huán)境中的放線菌,成為開(kāi)發(fā)新次級(jí)代謝產(chǎn)物的主要來(lái)源[2]。

    本文針對(duì)一株分離自西南印度洋2945 m深的海洋沉積物中的稀有放線菌新菌株Amycolatopsis sp.WP1,進(jìn)行發(fā)酵,以抗菌活性追蹤為導(dǎo)向,對(duì)其次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了研究。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

    Amycolatapsis sp.WP1是采自西南印度洋深海洋沉積物中的稀有放線菌新菌株,由國(guó)家海洋局第三研究所張改云老師鑒定[3],保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心,編號(hào)CGMCCNo.10738。

    金黃色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus AB 2010021)、大腸桿菌(Escherichia coli AB 94012)、白色念珠菌(Candida albicans AY 204006)、枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis CMCC(B)63501)為浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院保存。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基

    ISP2海水液體培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物4 g;麥芽提取物 10 g;葡萄糖4 g;海鹽 33 g;pH=7.3,121 ℃,1×105Pa滅菌 20 min待用。

    ISP2海水固體培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物4 g;麥芽提取物10 g;葡萄糖4 g;海鹽 33 g;瓊脂 15 g;pH=7.3,121 ℃,1×105Pa滅菌 20 min 待用。

    AM2 海水液體培養(yǎng)基(g/L):大豆粉 10 g,蛋白胨2 g,葡萄糖20 g,可溶性淀粉5 g,酵母提取物 2 g,K2HPO40.5 g, MgSO4·7H2O 0.5 g,CaCO32 g,pH=7.4,121 ℃,1×105Pa滅菌 20 min待用。

    1.2.2 菌株的發(fā)酵、萃取

    菌株在ISP2海水固體培養(yǎng)基活化后,挑取適量的單菌落接種到ISP2海水液體培養(yǎng)基中,于30℃,180 r/min下振蕩培養(yǎng)3 d,該菌液作為發(fā)酵的種子液。

    按照10%的接種量,將種子液接種到含有AM2海水液體培養(yǎng)基中,于30℃,180 r/min下振蕩培養(yǎng)5 d。發(fā)酵液在8000 r/min、4℃條件下離心10 min,取上清液,用等體積乙酸乙酯萃取二次后,乙酸乙酯層濃縮至干,稱重。

    1.2.3 粗提取物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定

    利用小孔樹(shù)脂MCI對(duì)粗提取物進(jìn)行初步分離,以純水、純水-甲醇(4 ∶1)、純水-甲醇(3 ∶2)、純水-甲醇(2 ∶3)、純水-甲醇(1 ∶4)、純甲醇各 2個(gè)柱體積依次洗脫,收集各個(gè)梯度洗脫液。將洗脫液旋蒸、濃縮,純水段舍棄,獲得5個(gè)分段,分別為 A、C、B、D、E段。用 DMSO將分段溶解成50 mg/mL的樣品,備用。選用革蘭氏陽(yáng)性菌金黃色葡萄球菌、枯草芽胞桿菌,革蘭氏陰性菌大腸桿菌,真菌白色念珠菌作為指示菌株,采用杯碟法檢測(cè)各個(gè)分段的抑菌活性[4]。

    對(duì)5段進(jìn)行HPLC分離純化,在分析型色譜柱 Phenomenex(USA,Luna 5u C18)進(jìn)行條件摸索,后用半制備型色譜柱(Agilent XDB C18)進(jìn)行分離,最后用分析型色譜柱純化得到單體化合物,通過(guò)NMR分析,文獻(xiàn)對(duì)比,確定化合物結(jié)構(gòu)。

    1.2.4 單體化合物的體外抗菌MIC評(píng)價(jià)

    DMSO溶解單體化合物使?jié)舛葹? mg/mL,備用。使用微量稀釋法對(duì)單體化合物進(jìn)行體外抗菌MIC評(píng)價(jià)[5]。將待測(cè)樣品加至96孔板中,利用新鮮培養(yǎng)基等倍稀釋成以下濃度梯度:100μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3.125 μg/mL、1.5625 μg/mL、0.7825 μg/mL, 并加入指示菌菌懸液至100 mL。等體積的DMSO作陰性對(duì)照,等體積的氨芐青霉素鈉或兩性霉素B作陽(yáng)性對(duì)照。細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)24 h,真菌在28℃下培養(yǎng)48 h后,觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以肉眼判斷無(wú)菌生長(zhǎng)的最低濃度為MIC(μg/mL)。

    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

    Amycolatapsis sp.WP1菌株共發(fā)酵培養(yǎng)100 L,獲得粗提取物23.5 g。

    2.1 粗提取物各分段的抗菌活性

    抑菌實(shí)驗(yàn)效果結(jié)果如圖1所示,D段對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌都有一定的抑制作用,A、C、E段只對(duì)金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用,5段對(duì)白色念珠菌均沒(méi)有抑制作用。

    圖1 各段的抗菌結(jié)果

    2.2 單體化合物的分離、結(jié)構(gòu)鑒定

    根據(jù)各段的不同,采用不同的分離條件,分離得到7個(gè)化合物,經(jīng)過(guò)NMR分析和文獻(xiàn)對(duì)比,確定化合物的結(jié)構(gòu)。

    圖2 化合物的結(jié)構(gòu)

    化合物1:淡黃色晶體,可溶于甲醇,分子式C16H12O5,分子量 284。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6):3.85 (3H, s), 6.40 (1H, d, J=1.7), 6.64(1H, d, J=1.65), 6.82 (2H, d, J=1.65), 7.37(2H,d,J=7.1),8.39 (1H, s),9.70 (1H,s),12.95 (1H, s);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6):56.22, 92.53, 98.18, 105.54, 115.23, 121.16,122.65,130.29,154.50,157.58,157.65,161.85,165.37, 180.56。 與文獻(xiàn)[6]對(duì)比,確定為櫻黃素(4',5-diidroxi-7-metoxiisoflavona)。

    化合物2:淡黃色晶體,可溶于甲醇、乙腈,分子式 C13H14O5,分子量 250。1H-NMR(500 MHz,CDCl3):2.35 (3H, s), 3.40 (3H, s), 3.90 (3H,s), 4.55 (2H, s), 6.04 (1H, s), 6.37 (1H, s),13.02 (1H, s);13C-NMR(125MHz,CDCl3):20.63,56.35, 58.39, 61.77, 89.79, 105.26, 109.08,109.28,158.37, 160.74,164.39,166.82,182.63。與文獻(xiàn)[7]對(duì)比,確定為6-甲氧基甲基丁香酚(6-methoxymethyleugenin)。

    化合物3:淡黃色晶體,可溶于甲醇,分子式C15H10O4,分子量254。淡黃色晶體,可溶于甲醇,分子式C15H10O5,分子量270。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6):6.80 (2H, d, J=8.6), 6.86 (1H, d,J=2.25), 6.93 (1H, dd, J=2.2, 8.7), 7.37(2H, d, J=8.8), 7.96 (1H, d, J=8.8), 8.29(1H, s), 9.53 (1H, s),10.76 (1H, s);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6):102.09, 114.94, 115.13,116.62, 122.53, 123.47, 127.30, 130.08, 152.84,157.17,157.43,165.52, 174.69。與文獻(xiàn)[8]對(duì)比,確定為 4', 7-二羥基異黃酮 (Daidzein, 4', 7-Dihydroxyisoflavone)。

    化合物4:淡黃色晶體,可溶于甲醇,分子式C15H10O5,分子量270。淡黃色晶體,可溶于甲醇,分子式C15H10O5, 分子量270。1H-NMR (500 MHz,DMSO-d6):6.23 (1H, d, J=2.1), 6.39 (1H, d,J=2.1), 6.82 (2H, d, J=8.65), 7.37 (2H, d,J=8.65), 8.33, (1H, s), 9.61 (1H,s),10.87(1H, bs), 12.96 (1H, s);13C-NMR (125 MHz,DMSO-d6):93.64,98.95,104.44,115.03,121.18,122.26, 130.13, 153.96, 157.39, 158.58, 161.98,164.27,180.19。 與文獻(xiàn)[9]對(duì)比,確定為 4',5,7-三羥 基 異 黃 酮 (Genistein, 4',5,7-trihydroxyisoflavone)。

    化合物5:白色針晶,可溶于甲醇,分子式C21H20O9,分子量 416。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6):3.16-3.72 (6H,m), 5.08 (1H,m), 6.81(2H, d, J=8.6), 7.14 (1H, dd, J=2.25, 8.85),7.23 (1H, d, J=2.25), 7.41 (2H, d, J=8.55),8.04 (1H, d, J=8.9), 8.39 (1H, s);13C-NMR(125 MHz,DMSO-d6):60.63, 69.62, 73.12,76.47, 77.21, 99.97, 103.37, 114.97, 115.58,118.46, 122.30, 123.69, 126.95, 130.08, 153.69,157.03,157.26,161.39, 178.74。與文獻(xiàn)[9]對(duì)比,確定為大豆苷,即4’,7-二羥基異黃酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖 (4',7-hydroxyisoflavone-7-O-β-D-glucopyranoside)。

    化合物6:白色針晶,可溶于甲醇,分子式C23H22O10,分子量 458。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6):3.74-4.45 (6H, m),5.16 (1H,d,J=7.35),6.82 (2H,d,J=8.6),7.13 (1H,dd,J=2.35,8.9),7.22 (1H,d,J=2.3),7.40 (2H,d,J=8.65), 8.05 (1H, d, J=8.9), 8.39 (1H, s);13CNMR(125 MHz,DMSO-d6):20.67, 63.09, 69.80,73.06, 73.81, 76.26, 99.65, 103.48, 115.02,115.49, 118.55, 122.27, 123.76, 127.00, 130.10,153.42, 157.02, 157.33, 161.15, 170.27, 174.79。與文獻(xiàn)[10]對(duì)比,確定為 6″-乙酰基-大豆苷(6″-O-acetylgenistin)。

    化合物7:白色針晶,可溶于甲醇,分子式C22H22O10,分子量 446。1H-NMR(500 MHz,DMSO-d6):3.88 (3H,s),4.61 (1H, t), 5.15 (1H, d,J=4.95), 5.43 (1H, d, J=2.7), 5.17 (2H, d, J=7.15), 5.43 (1H, d, J=2.7), 6.81 (2H, d, J=8.6), 7.32 (1H, s),7.40 (2H,d, J=8.6),7.48 (1H, s),8.38 (1H,s), 9.57 (1H,s);13CNMR(125 MHz,DMSO-d6):55.83, 60.62, 69.57,73.02, 76.76, 77.21, 99.61, 103.42, 104.72,114.99, 117.81, 122.59, 123.13, 130.08, 131.54,147.46,151.54,153.06,157.21, 174.39。 與文獻(xiàn)[11]對(duì)比,確定為黃豆黃苷(Glycitin)。

    2.3 單體化合物的MIC

    選用金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、白色念珠菌、枯草芽胞桿菌作為指示菌株,采用微量稀釋法對(duì)化合物進(jìn)行體外抗菌活性MIC評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,7個(gè)化合物對(duì)四株指示菌都沒(méi)有較好的活性(MIC>100 μg/mL)

    2.4 討論

    粗提取物具有抗菌活性,但最終沒(méi)有分離得到具有抗菌活性的化合物,分析原因:分離過(guò)程中,多使用紫外檢測(cè)器對(duì)化合物進(jìn)行分離,有些具有活性的化合物沒(méi)有較好的紫外吸收,或所選用的波長(zhǎng)不是該活性化合物最大吸收波長(zhǎng),因而在純化過(guò)程總可能被忽略舍棄;粗提物和各段中的多種化合物之間產(chǎn)生的抑菌作用協(xié)同、相加,表現(xiàn)出明顯的透明圈,而單個(gè)化合物可能產(chǎn)生的抑菌效果較弱;由于分離手段和分離經(jīng)驗(yàn)不足,使得具有良好抑菌效果的化合物沒(méi)有分離到。

    3 結(jié)論

    對(duì)一株深海來(lái)源的放線菌進(jìn)行發(fā)酵,發(fā)酵液經(jīng)乙酸乙酯萃取,得到粗提取物,以抗菌活性追蹤為導(dǎo)向,將粗提取物初步分離為5段,并對(duì)這5段進(jìn)行抗菌實(shí)驗(yàn),其中有4段對(duì)金黃色葡萄球菌都有較好的抑菌活性,有1段對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽胞桿菌都有很好的抑菌作用。進(jìn)一步的分離,得到7個(gè)已知化合物,分別是櫻黃素(1),6-甲氧基甲基丁香酚(2),4', 7-二羥基異黃酮(3),4',5,7-三羥基異黃酮(4),大豆苷(5),6″-乙酰基-大豆苷(6),黃豆黃苷(7),這 7個(gè)化合物均是首次在這株菌中分離得到。對(duì)這7個(gè)化合物做了抗菌活性評(píng)價(jià),MIC結(jié)果顯示,7個(gè)化合物都沒(méi)有較好的抗菌活性 (MIC>100μg/mL)。雖然這些化合物沒(méi)有顯示出較好的抗菌活性,但是生物活性導(dǎo)向仍然是活性化合物分離的重要方式。如何有效快速地分離得到具有生物活性的化合物,是微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的重點(diǎn)和難點(diǎn),加強(qiáng)海洋來(lái)源微生物的研究依然是重要和有意義的。

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