硫化氫熒光探針研究進(jìn)展

孫宗國(guó)，洪丹奇，謝振達(dá)，朱 勍

（浙江工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310014）

0 引言

由于熒光生物成像具有靈敏度高、選擇性好、反應(yīng)迅速、對(duì)細(xì)胞損傷小等優(yōu)點(diǎn)，所以被廣泛應(yīng)用于生物檢測(cè)技術(shù)中。在生物系統(tǒng)中，生理活性物質(zhì)的特征包括低濃度，高反應(yīng)性和短壽命。因此，精準(zhǔn)地確定這些物種的細(xì)胞內(nèi)濃度仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。為了迎合這些迫切需求，基于反應(yīng)型熒光探針出現(xiàn)了[1]。

細(xì)胞內(nèi)活性硫物質(zhì)（RSS）是含硫生物分子的總稱，這些分子在生理和病理過程中起關(guān)鍵作用。谷胱甘肽（GSH）是最豐富的細(xì)胞內(nèi)非蛋白質(zhì)硫醇，可以控制細(xì)胞內(nèi)的氧化還原活性，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因調(diào)控。半胱氨酸（Cys）牽涉到兒童生長(zhǎng)緩慢，肝損傷，皮膚病變，以及肌肉和脂肪的損失。同型半胱氨酸（Hcy）是一種導(dǎo)致阿爾茨海默病和維生素B12的不足[2]。H2S已被確定為繼一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）之后的第三種氣體遞質(zhì)。在生理水平，H2S調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)和基本信號(hào)處理過程，包括監(jiān)管血管緊張度，心肌收縮力，神經(jīng)傳遞和胰島素分泌。細(xì)胞中H2S水平異?？梢哉T發(fā)許多疾病，如阿爾茨海默病，肝硬化，胃粘膜損傷以及動(dòng)脈和肺部高血壓[3]。近年來，受益于H2S的化學(xué)反應(yīng)，硫化氫熒光探針迅速增加。

1 基于硝基還原成氨基的熒光探針

含有硝基熒光團(tuán)的探針設(shè)計(jì)存在一個(gè)主要障礙，主要因?yàn)橄趸徽J(rèn)為是熒光團(tuán)的強(qiáng)烈淬滅劑。然而，硝基在溫和的條件下可以被Na2S還原生成相應(yīng)的氨基基團(tuán)，這就為檢測(cè)H2S探針的設(shè)計(jì)合成提供了一種新方法。Wang等設(shè)計(jì)并合成了一種基于PET機(jī)制的熒光探針，此探針可以在HEPES緩沖液中用于胎牛血清中H2S的檢測(cè)[4]。七甲炔花菁類熒光探針通過硝基強(qiáng)吸電子作用產(chǎn)生PET效用，使熒光發(fā)生淬滅。另一方面，硝基被還原成氨基時(shí)，氨基是長(zhǎng)孤電子對(duì)的強(qiáng)供電子基團(tuán)，可能存在氨基到活性熒光團(tuán)的受體激發(fā)PET過程。由于取代效應(yīng)的存在，探針顯示出熒光發(fā)射的增加，以及量子產(chǎn)率從0.05增加到0.11。此探針被應(yīng)用于RAW264.7細(xì)胞中的H2S的監(jiān)測(cè)與跟蹤。

圖1 探針作用過程Figer 1 Probe process

2 基于硒亞砜還原成硒醚熒光探針

有機(jī)硒作為抗氧化酶谷胱甘肽過氧化物酶的活性部位，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)，防止活性氧造成的損害，硒酶的氧化還原過程主要取決于硒化物之間的雙向機(jī)制。利用催化劑的模擬循環(huán)可以幫助開發(fā)熒光探針可逆檢測(cè)硫化氫[5]。由于硒亞砜和硒醚是吸電子基團(tuán)和供電子基團(tuán)，熒光探針可以通過PET或ICT順利進(jìn)行。Han等人設(shè)計(jì)合成了可利用有機(jī)硒基團(tuán)監(jiān)測(cè)H2S和ROS之間的氧化還原循環(huán)的熒光探針，此可逆熒光探針可以檢測(cè)到H2S和HClO之間的氧化還原循環(huán)，該探針采用BODIPY熒光團(tuán)作為信號(hào)傳感器和4-甲氧基苯基硒基苯作為調(diào)節(jié)劑[6]，該探針在BODIPY熒光團(tuán)和4-甲氧基苯基硒基苯的PET作用下發(fā)生熒光淬滅效應(yīng)，但是氧化后的硒阻止了PET，使熒光發(fā)生Trun-on。量子產(chǎn)率從0.13增加到0.96。該探針可用于RAW264-7細(xì)胞中的HClO和H2S監(jiān)測(cè)。

圖2 探針作用過程Figer 2 Probe process

3 基于H2S親和反應(yīng)的熒光探針

H2S是可以參與活體中親核反應(yīng)的親和試劑，H2S的親和反應(yīng)主要包括邁克爾加成反應(yīng)、雙鍵加成反應(yīng)、硫解反應(yīng)。

3.1 基于邁克爾加成反應(yīng)的H2S熒光探針

Qian等人報(bào)道了采用BODIPY作為熒光團(tuán)的H2S熒光探針[7]，該探針的H2S識(shí)別基團(tuán)由α，β不飽和甲基丙烯酸鹽和醛基組成，醛基可以可逆地與H2S反應(yīng)形成半硫縮醛中間體，符合醛基與丙烯酸鹽的邁克爾加成反應(yīng)。該探針由于PET效應(yīng)使熒光淬滅，在與H2S反應(yīng)后熒光發(fā)生Turn-on，該探針可用于HeLa細(xì)胞中的H2S檢測(cè)。

圖3 探針作用過程Figer 3 Probe process

3.2 基于雙鍵加成反應(yīng)的H2S熒光探針

He等人設(shè)計(jì)了用于檢測(cè)H2S的比率熒光探針[8]，該探針可以認(rèn)為是香豆素和花菁通過乙烯組成的混合熒光團(tuán)，該探針得益于HS-與花菁在中性條件下的快速反應(yīng)，在HS-后，H2S在生理?xiàng)l件下，加入假吲哚C-2原子，探針的π共軛被打破，消除花菁基團(tuán)的發(fā)射，保留香豆素基團(tuán)發(fā)射，熒光光譜發(fā)生位移。該探針可以在30 s和80 s時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)溶液中和細(xì)胞中H2S的快速檢測(cè)，且熒光強(qiáng)度增加了120倍。該探針已被應(yīng)用與MCF-7細(xì)胞線粒體中H2S的檢測(cè)。

圖4 探針作用過程Figer 4 Probe process

3.3 基于硫解反應(yīng)的H2S熒光探針

Lin等人合成了基于H2S檢測(cè)的硫解反應(yīng)的近紅外熒光探針[9]，二硝基苯基團(tuán)用于保護(hù)肽中的酪氨酸合成，硫醇在一定條件下可以去除二硝基苯基團(tuán)。該探針由含有費(fèi)舍爾醛的BODIPY與1-氟-2，4-二硝基苯合成，該探針由活性染料的強(qiáng)吸電子基團(tuán)的d-PET過程，變現(xiàn)出無熒光。與H2S反應(yīng)后，熒光團(tuán)獲得釋放使熒光增加了18倍，檢測(cè)下限達(dá)到了10-8M。該探針可用于牛血清和MCF-7細(xì)胞中的H2S檢測(cè)。

圖5 探針作用過程Figer 5 Probe process

4 基于硫化酮沉淀的H2S熒光探針

與Cu（II）形成的金屬螯合物由于順磁性的Cu（II）可以接受熒光團(tuán)的激發(fā)態(tài)電子，從而對(duì)熒光團(tuán)有淬滅作用，當(dāng)除去Cu2+時(shí)，熒光復(fù)蘇。這種熒光探針通常由熒光團(tuán)-螯合劑-金屬離子組成。根據(jù)HSAB理論，S2-對(duì)Cu（II）具有很強(qiáng)的親和力，CuS沉淀相對(duì)穩(wěn)定。當(dāng)探針與H2S反應(yīng)后，Cu（II）將從絡(luò)合物中消除，熒光探針再次釋放出熒光。Chang等人合成了一種檢測(cè)S2-的熒光探針[10]，探針是含有二吡啶胺的熒光素的Cu2+螯合物，該探針在水溶液中檢測(cè)限為420 nM。

圖6 探針作用過程Figer 6 Probe process

5 疊氮化物還原成胺型熒光探針

疊氮化物和其他氧化氮物種被硫化氫還原成胺的速度比GSH和其他硫醇快，是可以檢測(cè)硫化氫的。在硫化氫還原后，吸電子疊氮基團(tuán)將被轉(zhuǎn)化為給電子氨基，因此，開發(fā)不同供電能力的取代基，導(dǎo)致多功能熒光探針被開發(fā)。

圖7 疊氮化物還原成胺型熒光探針總結(jié)Figer 7 Summary of strategies for fluorescent probes based on reducing azides to amines.

朱課題組研究了很多檢測(cè)硫化氫的熒光探針，在2018年，其課題組利用高效碳?xì)浠罨姆椒?，一步制備了全新的三氮唑喹啉類新型熒光染料[11]。此探針在8-氨基喹啉的基礎(chǔ)上，以5-三氮唑喹啉為發(fā)色團(tuán)，通過引入疊氮基團(tuán)，并在三氮唑基團(tuán)上連接溶酶體靶向基團(tuán)，成功構(gòu)建了高選擇性的硫化氫熒光探針。此探針由于喹啉與疊氮基團(tuán)之間存在PET作用，使探針具有熒光淬滅效果，在硫化氫存在時(shí)，PET效應(yīng)被打破，熒光Turn-on。

6 結(jié)論與展望

圖8 探針作用過程Figer 8 Probe process

本文介紹了基于反應(yīng)型H2S熒光探針的合成與作用原理。總之，探針的開發(fā)完善是一項(xiàng)具有挑戰(zhàn)性的任務(wù)，探針的開發(fā)解決了關(guān)鍵的生物問題。未來基于反應(yīng)的熒光探針設(shè)計(jì)應(yīng)注意內(nèi)源性小分子必須處于正常生理?xiàng)l件下。同時(shí)探針在避免天然物種的干擾下（如谷胱甘肽，半胱氨酸），應(yīng)對(duì)低濃度底物做出熒光變化，給出可靠的結(jié)果。所有這些都要求探針具有良好的選擇性，高靈敏度，良好的光穩(wěn)定性，低細(xì)胞毒性，適宜的水溶性，以及在生理pH范圍內(nèi)反應(yīng)的能力。熒光探針在臨床診斷中的應(yīng)用是最終目標(biāo)。