魚(yú)腥草活性成分槲皮素及其金屬配合物的抗菌活性

徐海瑛， 郝紅英， 陳青閣， 趙優(yōu)琴， 李玉魁， 周小漫， 馬 欣， 丁燕偉

(黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450063)

魚(yú)腥草(Houttuyniacordata)為三白草科蕺菜屬植物，主要產(chǎn)于浙江、江蘇、安徽、福建、河南等省，作為藥食兩用的植物，魚(yú)腥草具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋等功能[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，魚(yú)腥草具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎癥、抗腫瘤和提高免疫力等生理功效[2]。此外，魚(yú)腥草含有多種活性物質(zhì)成分，主要活性物質(zhì)有揮發(fā)油和黃酮類化合物，如魚(yú)腥草素、槲皮素、槲皮苷等[3]。槲皮素是植物界分布最廣的黃酮類化合物，有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性[4-6]。由于槲皮素的水溶性較差，人們通常對(duì)槲皮素進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾。槲皮素對(duì)金屬離子有很強(qiáng)的螯合作用，可以產(chǎn)生穩(wěn)定的環(huán)狀化合物，因此，近年來(lái)人們對(duì)槲皮素配合物的研究逐漸增多，成為開(kāi)發(fā)利用槲皮素的新途徑。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外研究者已經(jīng)合成了30多種槲皮素金屬配合物，有些金屬配合物具有顯著的抗氧化、抗炎、抗菌活性[7]。關(guān)于魚(yú)腥草有效成分單體及其金屬配合物對(duì)耐藥菌株抗菌活性的研究較少。在提取魚(yú)腥草中槲皮素及合成槲皮素金屬配合物的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)選擇臨床上常見(jiàn)的致病菌——金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，簡(jiǎn)稱SA)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa，簡(jiǎn)稱PA)的標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株研究槲皮素單體及其金屬配合物的抗菌活性，以期為開(kāi)發(fā)槲皮素提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藥品 魚(yú)腥草活性成分槲皮素單體，槲皮素-Zn(鋅)、槲皮素-Mn(錳)、槲皮素-Cu(銅)、槲皮素-Fe(鐵)、槲皮素-Mg(鎂)等金屬配合物，均由黃河科技學(xué)院化學(xué)實(shí)驗(yàn)室郝紅英副教授所在課題組提供。

1.1.2 菌種 銅綠假單胞菌[美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)(ATCC)保藏編號(hào)：ATCC27853]、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。銅綠假單胞菌耐藥菌株、金黃色葡萄球菌耐藥菌株由黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供。

1.1.3 試劑與儀器 M-H(A)培養(yǎng)基(即水解酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基)、M-H(B)培養(yǎng)基(即水解酪蛋白肉湯培養(yǎng)基)、LB培養(yǎng)基，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)、二甲基亞砜(DMSO)，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)，上海錦昱科學(xué)儀器有限公司；GH-500BC隔水恒溫培養(yǎng)箱，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；DRAGONLAB微量移液槍，深圳良誼實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司。

1.2 方法

采用WHO(世界衛(wèi)生組織)推薦的瓊脂稀釋法，通過(guò)測(cè)定最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，簡(jiǎn)稱MIC)，評(píng)價(jià)槲皮素單體及其金屬配合物的抗菌活性[8-10]。

1.2.1 藥液制備 分別稱取槲皮素單體及其金屬配合物各100 mg，置于EP(eppendorf)管中，再加入二甲基亞砜(DMSO)2 mL，輕輕振搖，使得藥物充分溶解，配制成濃度為 50 mg/mL 的原液，將原液分別用DMSO等倍稀釋成濃度為25、12.5、6.25、3.125、1.562 5、0.781 25 mg/mL的藥液。放入4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 菌液制備 分別將SA和PA的標(biāo)準(zhǔn)菌株、耐藥菌株接種在LB培養(yǎng)基上，于37 ℃溫箱培養(yǎng)18～24 h。再將培養(yǎng)良好的上述細(xì)菌在無(wú)菌條件下接種至M-H肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃溫箱培養(yǎng)4～6 h，將增菌后的菌液用生理鹽水校正濃度至1.5×108CFU/mL，再用MH肉湯將菌懸液進(jìn)行 1 ∶1 000 稀釋后備用，含菌量約為105CFU/mL。

1.2.3 抑菌試驗(yàn) 配制M-H(A)培養(yǎng)基，并分裝于試管中，將培養(yǎng)基進(jìn)行高壓蒸汽滅菌(121 ℃、20 min)，然后將培養(yǎng)基置于70 ℃恒溫水浴箱中備用。在超凈臺(tái)中將M-H(A)培養(yǎng)基倒入無(wú)菌塑料培養(yǎng)皿中，加入已制備好的各濃度藥液，充分混勻，靜置凝固成含藥平板，使藥物的終濃度為5、2.5、1.25、0.63、0.31、0.17、0.08 mg/mL，DMSO的體積分?jǐn)?shù)為10%。同時(shí)設(shè)空白對(duì)照和溶劑對(duì)照平板。每種濃度的藥物和對(duì)照均設(shè)3次重復(fù)。在超凈臺(tái)中，取2 μL已制備好的菌液，點(diǎn)接種于含藥平板上的相應(yīng)位置，標(biāo)記后置于37 ℃溫箱內(nèi)培養(yǎng)18 h。然后通過(guò)無(wú)菌操作在細(xì)菌接種點(diǎn)處加10 μL 0.5% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑，置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)2～4 h后觀察結(jié)果。

1.2.4 結(jié)果判定和處理 觀察平板中細(xì)菌接種處的菌落顏色變化，細(xì)菌接種點(diǎn)顯示紅色，表示細(xì)菌生長(zhǎng)，記錄為“+”；細(xì)菌接種點(diǎn)不顯示紅色，表示細(xì)菌未生長(zhǎng)，記錄為“-”。細(xì)菌未生長(zhǎng)時(shí)的最小藥物濃度即為該藥物對(duì)該細(xì)菌的最小抑菌濃度，計(jì)算重復(fù)試驗(yàn)MIC的平均值。數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理分析。

2 結(jié)果與分析

TTC是一種活菌染料，活細(xì)菌中的琥珀酸脫氫酶能將TTC還原成紅色的甲瓚(Formazan)，從而使培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色，而死細(xì)菌則為無(wú)色，因此細(xì)菌培養(yǎng)物顯示紅色表示有細(xì)菌生長(zhǎng)，反之則表示無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。經(jīng)試驗(yàn)測(cè)定，空白對(duì)照和DMSO溶劑對(duì)照中的4種菌株接種點(diǎn)處均顯示紅色，說(shuō)明空白對(duì)照平板和溶劑對(duì)照平板上4種菌株生長(zhǎng)良好，10% DMSO對(duì)4種菌株生長(zhǎng)無(wú)任何影響，藥物濃度是影響細(xì)菌生長(zhǎng)的因素之一。MIC是細(xì)菌未生長(zhǎng)時(shí)的最小藥物濃度，MIC值越小，說(shuō)明藥物的抑菌作用越強(qiáng)。

2.1 對(duì)SA的抗菌活性

由表1、圖1可以看出，對(duì)于SA標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25923，槲皮素單體的MIC為1.88 mg/mL，槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg的MIC分別為0.31、3.75、5.00、5.00 mg/mL，而槲皮素-Fe的MIC大于 5.00 mg/mL。槲皮素-Zn的抑菌作用強(qiáng)于槲皮素單體(P<0.01)，而槲皮素-Mn(P<0.05)、槲皮素-Cu(P<0.01)、槲皮素-Mg(P<0.01)、槲皮素-Fe的抑菌活性弱于槲皮素單體。

表1 槲皮素及其金屬配合物的最小抑菌濃度

注：“*”表示與槲皮素組相比差異顯著(P<0.05)，“**”表示與槲皮素組相比差異極顯著(P<0.01)。

由表1、圖2可以看出，對(duì)于SA耐藥菌株，槲皮素單體的MIC為0.94 mg/mL，槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg的MIC分別為0.94、3.75、3.75、5.00 mg/mL，而槲皮素-Fe的MIC大于5 mg/mL。槲皮素-Zn和槲皮素單體的抑菌作用相當(dāng)，而槲皮素-Mn(P<0.01)、槲皮素-Cu(P<0.01)、槲皮素-Mg(P<0.01)、槲皮素-Fe的抑菌活性弱于槲皮素單體。

2.2 對(duì)PA的抗菌活性

對(duì)于PA標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25893，槲皮素單體的MIC為 0.94 mg/mL，槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Fe的MIC分別為0.47、5.00、1.88、1.88、0.94 mg/mL。槲皮素-Zn的抑菌作用強(qiáng)于槲皮素單體(P<0.05)，槲皮素-Mn(P<0.01)、槲皮素-Cu(P<0.05)、槲皮素-Mg(P<0.05)的抑菌活性弱于槲皮素單體，槲皮素-Fe和槲皮素單體的抑菌活性相當(dāng)(表1和圖3)。

對(duì)于PA耐藥菌株，槲皮素單體的MIC為 1.88 mg/mL，槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Fe的MIC分別為0.63、1.88、5.00、5.00、5.00 mg/mL。槲皮素-Zn的抑菌作用強(qiáng)于槲皮素單體(P<0.01)，槲皮素-Mn和槲皮素單體的抑菌活性相當(dāng)，槲皮素-Cu(P<0.01)、槲皮素-Mg(P<0.01)、槲皮素-Fe(P<0.01)的抑菌活性弱于槲皮素單體(表1和圖4)。

3 討論與結(jié)論

SA為革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)，是引起化膿性感染(如毛囊炎、肺炎、膿毒癥、敗血癥等)的常見(jiàn)致病菌之一[11]。PA為革蘭氏陰性菌(G-)，是引起醫(yī)院感染的重要條件致病菌之一。近年來(lái)，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌的耐藥性問(wèn)題愈加突出，如耐藥性SA、耐藥性PA，這些耐藥菌感染對(duì)人體健康都構(gòu)成了極大威脅[12-13]。中草藥因?yàn)榫哂胁涣挤磻?yīng)小、資源豐富、價(jià)格低廉、作用靶位多、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)而受到越來(lái)越多的關(guān)注。作為魚(yú)腥草有效成分之一的槲皮素，具有多種生物活性，其作為金屬離子螯合配體也一直倍受關(guān)注[7]。本試驗(yàn)研究了槲皮素單體及其5種金屬配合物對(duì)SA和PA的質(zhì)控菌株、耐藥菌株的抗菌活性。

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素、槲皮素-Zn、槲皮素-Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Fe對(duì)SA、PA的標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株均有抗菌活性。其中，槲皮素-Zn的抗菌活性強(qiáng)于槲皮素單體，而其他金屬配合物的抗菌活性要弱于槲皮素。對(duì)于SA標(biāo)準(zhǔn)菌株，槲皮素-Zn的抗菌活性最強(qiáng)，其MIC為 0.31 mg/mL，其他抗菌活性強(qiáng)弱順序?yàn)殚纹に?、槲皮?Mn、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Fe；對(duì)于PA標(biāo)準(zhǔn)菌株，槲皮素-Zn的抗菌活性最強(qiáng)，其MIC為0.47 mg/mL，其他抗菌活性強(qiáng)弱順序?yàn)殚纹に?、槲皮?Fe、槲皮素-Cu、槲皮素-Mg、槲皮素-Mn；對(duì)于SA耐藥菌株，槲皮素-Zn和槲皮素抑菌活性相當(dāng)，而其他金屬配合物要弱于槲皮素；對(duì)于PA耐藥菌株，槲皮素-Zn的抑菌活性要強(qiáng)于槲皮素，槲皮素-Mn和槲皮素的抑菌活性相當(dāng)，其他金屬配合物弱于槲皮素。本研究結(jié)果顯示，槲皮素及其金屬配合物可以抑制SA、PA的標(biāo)準(zhǔn)菌株和耐藥菌株生長(zhǎng)，從而為臨床治療耐藥菌感染提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用槲皮素提供了理論依據(jù)。