百宜黑雞PRLR基因多態(tài)性對產蛋性能的影響

吳松成， 韓 雪， 陳 林， 伍革民， 粟朝芝， 朱麗莉， 陶宇航

(1.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州貴陽 550005； 2.貴州大學高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，貴陽貴州 550025)

催乳素(prolactin，PRL)是由腺垂體催乳素細胞合成和分泌的一種肽類激素，主要作用于動物的性腺和乳腺，催乳素與其受體(prolactin receptor，PRLR)結合后作用于靶細胞，調節(jié)繁殖相關激素的分泌，促進基因表達[1-3]。利用PRLR基因的作用機制，將其作為影響動物繁殖性能的候選基因有著重要意義。近年來，越來越多的研究者對催乳素受體基因進行大量報道，劉遠等報道，PRLR基因的優(yōu)勢基因型個體能夠顯著提高大白豬的窩產仔數(shù)[4]；張陳華等研究指出，PRLR基因的多態(tài)性對圩豬和定遠豬的產仔數(shù)有一定影響[5]；Tomas等發(fā)現(xiàn)，PRLR基因外顯子突變能夠顯著影響豬的排卵率和仔豬存活率[6]；Chu等認為，PRLR基因與羊的產羔數(shù)相關[7-8]。但是以上的研究均是對家畜的研究報道，對于家禽的研究甚少。洪坤月報道，PRLR基因多態(tài)性對雞的早期平均蛋質量有一定的影響，而對開產日齡、蛋型指數(shù)、早期產蛋量等影響不顯著(P>0.05)[9]。百宜黑雞是貴州省的優(yōu)良地方品種，但由于近年來外來品種的引進，加之農戶的粗放型飼養(yǎng)，人為因素過強地干預選育，百宜黑雞品種資源岌岌可危。本試驗以百宜黑雞為研究對象，以期尋找有效的分子遺傳標記，為該品種進一步的開發(fā)利用、保種等提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

百宜黑雞由貴州省貴陽市烏當區(qū)百宜鄉(xiāng)貴州農農農生態(tài)農業(yè)開發(fā)有限公司的種雞場提供。隨機抽取同一日齡、相同飼養(yǎng)管理水平的95羽百宜黑雞雞翅靜脈采血5 mL/羽，EDTA抗凝，放冰盒帶回實驗室，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于基因組DNA提取。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取 試驗采用血液/細胞/組織基因組DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]分別對95羽百宜黑雞血液中基因組DNA抽提，并用Thermo Fisher微量紫外分光光度計對所獲得的DNA進行濃度和純度測定，1.0% 瓊脂糖凝膠檢測其完整性。

1.2.2 引物設計及PCR擴增 根據(jù)GenBank發(fā)布的家雞PRLR基因序列(登錄號：NC_006127.4)，利用引物設計軟件Primer 5.0對雞PRLR基因設計2對特異性引物，分別對外顯子3(PRLR-1)和外顯子6(PRLR-2)進行擴增，引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，引物信息見表1。PCR擴增反應采用30 μL體系：上、下游引物各2 μL，DNA模板3 μL，2×TaqPCR Master Mix 14 μL，雙蒸水9 μL。反應程序：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃變性40 s，退火35 s(退火溫度詳見表1)，72 ℃延伸40 s，32個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

表1 百宜黑雞PRLR基因擴增引物詳細信息

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007對數(shù)據(jù)進行分類統(tǒng)計，DNAstar進行序列分析比對，用SPSS 18.0中GLM模型對不同基因型與產蛋性能間的關聯(lián)性進行相關分析，結果以“平均值±標準差”體現(xiàn)。

2 結果與分析

2.1 PCR產物檢測

以百宜黑雞基因組DNA為模板，分別對2對引物進行PCR擴增，產物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測，結果發(fā)現(xiàn)，目的條帶與預期結果一致，且引物特異性良好，PCR產物無須純化可直接用于測序(圖1)。

2.2 PCR產物測序及序列分析

根據(jù)目的片段擴增結果，將PCR產物全部送往北京諾賽基因組研究中心有限公司進行直接測序。測序結果經DNAstar拼接并與GenBank發(fā)布的家雞PRLR基因序列進行校正、比對，結果在試驗群體的PRLR基因中發(fā)現(xiàn)只存在1個SNP位點(圖2)，在百宜黑雞PRLR基因外顯子3的36 bp位置發(fā)生了C/T突變(36C/T)，然而外顯子6區(qū)域并未找到突變位點。

2.3 百宜黑雞PRLR基因遺傳特性分析

測序結果經序列對比發(fā)現(xiàn)，在試驗群體的PRLR基因中找到了1個SNP，根據(jù)這個SNP位點將其對應的純合子和雜合子命名為CC型和CT型。根據(jù)表2統(tǒng)計的結果可知，該位點對應的基因型CC基因型為優(yōu)勢基因型(0.957 9)，等位基因C為優(yōu)勢等位基因(0.978 9)。χ2適合性檢驗表明，該基因座的位點不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.05)；PIC=0.041 7<0.25，屬于低度多態(tài)。

表2 百宜黑雞PRLR基因多態(tài)位點基因型頻率及等位基因頻率

2.4 PRLR基因與產蛋性能關聯(lián)分析

根據(jù)SNP分型的結果，對不同基因型與產蛋性能間的關聯(lián)性進行分析，百宜黑雞PRLR基因36C/T位點與產蛋性能的顯著性關系分析結果如表3所示，由表3可知，任何一種基因型與總蛋個數(shù)以及蛋均質量之間均不呈顯著關系(P>0.05)。

表3 PRLR基因多態(tài)位點與肉質性狀關聯(lián)分析

3 討論與結論

由于生產性能直接決定著經濟效益，因此對養(yǎng)殖戶或者育種家來說，在追求動物快速增長的同時更加注重其生產性能。王健等研究表明，鵝PRLR基因的表達受PRL基因的調控[10]；高天等研究表明，PRLR基因多態(tài)性極顯著影響嘉興黑豬的總產仔數(shù)、產活仔數(shù)、死胎數(shù)和初生均質量(P<0.01)[11]；孫延曉等研究發(fā)現(xiàn)，PRLR基因對豬的平均窩產數(shù)有影響[12]；洪月坤報道，PRLR基因外顯子3多態(tài)性對雞的產蛋性能無影響[9]。由此可見，不同的物種或品種得出的結論是不一致的。本研究以百宜黑雞為研究對象，在試驗群體的PRLR基因的外顯子3發(fā)現(xiàn)了1個SNP，χ2適合性檢驗表明，該基因座的位點不處于Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P<0.05)，這可能是抽樣誤差、樣本數(shù)較少造成的，也有可能是人工過度選育結果所致。將該突變位點與總蛋數(shù)和平均蛋質量進行顯著性分析發(fā)現(xiàn)，該位點的任何一種基因型對這2項生產數(shù)據(jù)均不顯著，這一結果與前人研究結果[9]有一定的相似之處，但尚不清楚是品種原因還是基因特性，因此，筆者所在課題組今后將會加大樣本數(shù)量和雞品種進行進一步驗證。本試驗結果為后期原核或真核表達載體的構建提供了理論依據(jù)，對百宜黑雞品種的開發(fā)利用、保種選育提供了理論資料。