小麥粒重基因等位變異的高通量分子檢測及組合分析

仝靖洋，李少鵬，劉勝杰，張琳雪，梁園園，張 哲，聶小軍，李學軍，王中華，高 欣

(西北農林科技大學農學院，陜西楊凌 712100)

小麥產量三因素包括穗數(shù)、穗粒數(shù)和千粒重，研究表明，千粒重的遺傳力較大且最為穩(wěn)定[1]。小麥粒重主要由粒長、粒寬和粒厚決定[2]，是由很多相關基因所控制的數(shù)量性狀，研究表明，這些基因的變異會導致籽粒大小及粒重產生變異[3]。分子標記輔助選擇有助于更高效準確地選擇目標基因，可以縮短育種進程[4]。建立高通量分子檢測技術可為分子標記輔助選擇提供高效檢測平臺，大大提高選育效率，適合于大規(guī)模的分子標記輔助選擇育種。

目前開發(fā)出的高通量測序(NGS)技術、競爭性等位基因特異性PCR(KASP)技術、變性高效液相色譜(DHPLC)技術、SNP芯片系統(tǒng)、Taqman探針技術及高分辨率熔解曲線分析(HRM)技術可對以SNP為核心的高通量分子標記進行檢測[5-6]。其中，HRM技術是一種基于單堿基熔解溫度差異而釋放不同強度的熒光信號，根據(jù)不同DNA片段特異的熔解曲線實現(xiàn)基因分型的新技術，具有成本低、結果準確、靈敏度較高等優(yōu)點，在供測基因型較少、樣品量較多時具有顯著優(yōu)勢[7]。近些年來，HRM已成功應用于各類遺傳病的檢測[8]，在植物種質資源鑒定方面也發(fā)展迅速，已報道的植物種類有水稻(OryzasativaL.)[9]、菜豆(PhaseolusvulgarisL.)[10]等。寇 程等[4]首次將此技術引入小麥中，成功實現(xiàn)了小麥粒重基因高通量分型，但是目前此技術在小麥中的應用較少。

目前，數(shù)量性狀位點(QTL)分析已被廣泛用于小麥籽粒表型性狀的研究，在小麥絕大多數(shù)染色體上已報道了很多千粒重的QTLs[11]。近幾年來，隨著比較基因組學的發(fā)展，小麥粒重相關基因的克隆成為研究熱點，一些粒重相關基因已被克隆[12]。 TaGW2-6A>基因位于小麥6A染色體上，是第一個被克隆的粒重基因。Su等[13]克隆了 TaGW2-6A>基因的啟動子區(qū)并檢測到兩個SNP，命名為 Hap-6A-A>和 Hap-6A-G>兩種單倍型，并設計了普通PCR分子標記，關聯(lián)分析表明 Hap-6A-A>單倍型可顯著增加小麥粒寬和粒重；Yang等[14]發(fā)現(xiàn)蘭考大粒中 TaGW2-6A>基因編碼區(qū)有一個T堿基插入等位變異(命名為TT單倍型)，其顯著增加了小麥粒寬和粒重；寇 程等[15]開發(fā)的HRM技術實現(xiàn)了對 TaGW2-6A>基因等位變異的高通量檢測，并利用此技術發(fā)現(xiàn)上述兩組等位變異存在互作，且 Hap-6A-A>及TT組合為優(yōu)異變異組合；近年來，已有研究證明了 TaGW2-6A>基因等位變異對小麥籽粒表型性狀具有重要作用[16]。 TaCwi-A1>基因編碼的細胞壁轉化酶(CWI)是小麥庫器官發(fā)育和碳分配的關鍵酶，與粒重有很高的相關性。Ma等[17]克隆了小麥2A染色體上 TaCwi-A1>基因的編碼序列并發(fā)現(xiàn)存在 TaCwi-A1a>(2727T和2845T)和 TaCwi-A1b>(2727G和2845G)兩種等位變異型，開發(fā)出顯性互補標記CW122和CWI21，關聯(lián)分析表明 TaCwi-A1a>顯著增加小麥粒重；相吉山等[18]和劉永偉等[19]利用上述標記分別對新疆小麥和黃淮麥區(qū)小麥中 TaCwi-A1>不同基因型品種的千粒重進行了比較分析，結果與Ma等[17]的結果一致。 TaSus2-2B>基因編碼的蔗糖合成酶(Sus)與小麥淀粉合成及胚乳形成有關，最終影響籽粒重量。Jiang等[20]克隆了小麥2B染色體上 TaSus2-2B>基因的編碼序列并檢測到3個SNP，命名為 SUS2-2B-H>和 SUS2-2B-L>兩種單倍型，開發(fā)了一個共顯性標記TaSus2-2Btgw，關聯(lián)分析表明 SUS2-2B-H>顯著增加小麥千粒重；Hou等[21]對含有 TaSus2-2B>的基因不同基因型品種的千粒重進行比較分析，結果與Jiang等[20]的結果一致。

綜上所述， TaCwi-A1>、 TaGW2-6A>及 TaSus2-2B>基因均為重要的粒重相關基因，目前對這些基因的等位變異類型已有研究，且得到了較為一致的結果。但是，這些研究絕大多數(shù)為單個基因的效應分析，對已克隆的粒重基因的綜合效應分析報道較少。目前，基于普通PCR和瓊脂糖凝膠電泳技術，已經開發(fā)出上述基因的功能標記，這些標記可直接用于育種材料的檢測，但實驗操作步驟復雜且無法達到高通量分子檢測的要求。本研究以我國262份小麥微核心種質為材料，利用HRM技術分別檢測 TaCwi-A1>和 TaGW2-6A>基因啟動子區(qū)和編碼區(qū)及 TaSus2-2B>基因的等位變異，研究各個等位變異及變異組合與小麥粒長、粒寬和千粒重的相關性，并對各變異組合在我國十個麥區(qū)的分布情況進行分析，旨在探究上述粒重基因變異組合對籽粒表型性狀的綜合效應，同時進一步探討優(yōu)異變異對籽粒表型性狀的增效作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料及性狀測定

以262份小麥微核心種質(192份地方品種，70份選育品種)為供試材料，約占我國現(xiàn)有小麥種質資源的1%，可代表我國小麥遺傳多樣性的70%以上[22]。2013-2014年度分別種植于中國農業(yè)科學院(北京)、河南省洛陽農林科學院，2014-2015年度種植于西北農林科技大學(陜西楊凌)試驗地。

用SC-G型自動考種儀及千粒重儀(杭州萬深檢測科技有限公司)，測量粒長、粒寬及千粒重，每份材料的每一項指標都重復3次，計算平均值。

用SPSS 22和Microsoft Excel 2010軟件分析處理調查數(shù)據(jù)，用LSR(least significance ranges)法分別比較各組基因型間的差異顯著性；用SAS8軟件的MEANS過程通過LSD(least significance difference)法比較各基因組合間的差異顯著性。

1.2 粒重基因等位變異的分子檢測

1.2.1 DNA提取與引物設計

每個品種取新鮮葉片0.2～0.3 g，利用CTAB法提取基因組DNA。分別根據(jù) TaCwi-A1>基因的T/G變異位點附近序列及 TaSus2-2B>基因的 TaSus2-2B>-H和 TaSus2-2B-L>等位變異位點附近序列設計引物組合HRM-CWI和HRM-P， TaGW2-6A>基因的等位變異檢測引物為寇 程等[4]設計的引物組合HRM-T和HRM-A(表1)。

表1 用于HRM檢測不同基因等位變異的引物Table 1 Primers for allelic variation detection by high-resolution melting curve analysis

1.2.2 HRM檢測分析

HRM的反應體系為12.5 μL，含DNA模板60 ng，上下游引物各0.375 μmol·L-1，LightCycler HRM Master Mix(Roche)6.25 μL，Mg2+濃度為1.5 mol·L-1。HRM反應在Roche LightCycler 96儀上進行。普通PCR反應程序為：94 ℃,5 min；94 ℃,30 s，56 ℃,29 s，72 ℃,6 s，45個循環(huán)；72 ℃ 2 min。HRM分析程序為：95 ℃反應30 s(堿基與熒光染料結合)；50 ℃溫育30 s(復性)，隨后逐漸升溫至95 ℃，期間每升高 1 ℃ 收集25次熒光信號。HRM分析程序完成后迅速降至37 ℃，整個HRM分析完成。

1.2.3 HRM分析結果的驗證

赤殼和碧螞4號兩份材料，紅皮小麥、晉麥2148、松蕊麥(四號)與內麥11四份材料的HRM反應產物分別用于 TaCwi-A1>基因和 TaSus2-2B基因等位變異檢測結果的驗證。PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳分離，回收目的片段連接到pUCm-T載體(Takara,日本)上進行遺傳轉化，將陽性單克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序驗證。為確保核苷酸序列的準確性，每個品種至少測3個克隆。利用DNAMAN軟件進行序列比對與分析。

2 結果與分析

2.1 不同基因型的HRM分析

2.1.1 TaCwi-A1>基因不同基因型的HRM分析

基于熔解曲線形狀的不同，能夠明顯地區(qū)分出赤殼和碧螞4號兩份材料高分辨率熔解曲線的差異(圖1A)。在86～89 ℃時，赤殼的相對熒光單位(RFU)的差異高于碧螞4號。擴增序列比對分析顯示，赤殼和碧螞4號擴增產物中24 bp和143 bp處發(fā)生T/G堿基替換(圖2A)，產生了不同的熔解曲線。HRM分析結果表明，在262份材料中有186份材料的熔解曲線與赤殼的熔解曲線相近，76份材料的熔解曲線與碧螞4號的熔解曲線相近(圖1D)，說明供試材料中 TaCwi-A1a>基因型材料有186份， TaCwi-A1b>基因型材料有76份。

2.1.2 TaGW2-6A>基因不同單倍型的HRM分析

基于熔解曲線形狀的不同，能夠明顯地區(qū)分出 TaGW2-6A>基因編碼區(qū)TT/tt等位變異和啟動子區(qū) Hap-6A-A>/ Hap-6A-G>等位變異高分辨率熔解曲線的差異。在72～80 ℃時，tt單倍型的相對熒光單位(RFU)的差異高于TT單倍型(圖1B)；在72～76 ℃時， Hap-6A-G>單倍型的相對熒光單位(RFU)的差異高于 Hap-6A-A>單倍型(圖1E)。HRM分析結果表明，在262份供試材料中有TT單倍型材料16份，tt單倍型材料246份； HAP-6A-A>單倍型材料115份， Hap-6A-G>單倍型材料147份。

TT和tt：TT單倍型和tt單倍型材料；HP和JM2148：紅皮小麥( SUS2-2B-H>)和晉麥2148( SUS2-2B-H>)；SR4和NM11：松蕊麥(四號)( SUS2-2B-L>)及內麥11( SUS2-2B-L>)； TaCwi-A1a>和 TaCwi-A1b>： TaCwi-A1a>基因型和 TaCwi-A1b>基因型材料； HAP-6A-A>和 HAP-6A-B>： HAP-6A-A>單倍型和 HAP-6A-B>單倍型材料； SUS2-2B-H>和 SUS2-2B-L>： SUS2-2B-H>基因型和 SUS2-2B-L>基因型材料。
TTandtt：TTandtthaplotypes；HP and JM2148：Hongpimai( SUS2-2B-H>) and Jinmai 2148( SUS2-2B-H>)；SR4 and NM11：Songruimai 4( SUS2-2B-L>) and Neimai 11( SUS2-2B-L>)； TaCwi-A1a and TaCwi-A1b>： TaCwi-A1a and TaCwi-A1b genotypes； HAP-6A-A and HAP-6A-G>： HAP-6A-A and HAP-6A-G haplotypes； SUS2-2B-H and SUS2-2B-L>： SUS2-2B-H and SUS2-2B-L genotypes.

圖1供試材料的高分辨率熔解曲線分析圖
Fig.1High-resolutionmeltingcurveanalysisofthetestedmaterials

A： TaCwi-A1a>基因型材料和 TaCwi-A1b>基因型材料擴增產物的序列比對；B： SUS2-2B-H>基因型材料和 SUS2-2B-L>基因型材料擴增產物的序列比對。方框表示堿基替換的位置。A:Sequence alignment of amplified fragments referring to TaCwi-A1a and TaCwi-A1b genotypes. B:Sequence alignment of amplified fragments referring to SUS2-2B-H> and SUS2-2B-L genotypes. The box indicates the position of the base substitution.

2.1.3 TaSus2-2B> 基因不同基因型的HRM分析

基于熔解曲線形狀的不同，能夠明顯地區(qū)分出紅皮小麥( SUS2-2B-H>)、晉麥2148( SUS2-2B-H>)、松蕊麥(四號)( SUS2-2B-L>)與內麥11( SUS2-2B-L>)四份材料高分辨率熔解曲線的差異(圖1C)。在85～87 ℃時，紅皮小麥和晉麥2148的相對熒光單位(RFU)的差異高于松蕊麥(四號)和內麥11。擴增序列比對分析顯示，紅皮小麥、晉麥2148、松蕊麥(四號)與內麥11擴增產物中164 bp處發(fā)生T/C堿基替換(圖2B)，產生了不同的熔解曲線。HRM分析結果表明，在262份材料中有85份材料的熔解曲線形狀與紅皮小麥和晉麥2148的熔解曲線相近，177份材料的熔解曲線形狀與松蕊麥(四號)和內麥11的熔解曲線相近(圖1F)，表明供試材料中 SUS2-2B-H>基因型材料有85份， SUS2-2B-L>基因型材料有177份。

2.2 粒重基因等位變異及變異組合與籽粒的表型差異顯著性分析

2.2.1 TaCwi-A1>基因等位變異與籽粒表型的差異顯著性分析

分析結果表明， TaCwi-A1>等位變異對千粒重有顯著影響。 TaCwi-A1a>單倍型材料與 TaCwi-A1b>單倍型材料的千粒重呈顯著性差異(P<0.05)，粒長和粒寬無顯著性差異(表2)。說明 TaCwi-A1a>單倍型能增加小麥的粒重，為優(yōu)異的等位變異。

表2 各基因等位變異的表型差異顯著性分析Table 2 Correlation analysis between kernel size and allelic variations of related genes

2.2.2 TaGW2-6A>基因等位變異與籽粒的表型差異顯著性分析

分析結果表明，TT/tt等位變異對粒寬和千粒重有顯著影響， Hap-6A-A>/ Hap-6A-G>等位變異對粒長、粒寬及粒重均無顯著影響。TT與tt單倍型材料的粒寬、千粒重差異顯著(P<0.01)，粒長無顯著性差異；而 Hap-6A-A>型材料與 Hap-6A-G>型材料的粒長、粒寬、千粒重均無顯著性差異。TA型與tA型和TG型的粒長(P<0.05)、粒寬(P<0.05)及千粒重(P<0.01)均呈顯著或極顯著性差異，與tG型材料的粒長無顯著性差異，但與tG型材料的粒寬(P<0.05)和千粒重(P<0.01)呈顯著或極顯著性差異(表2)。因此，TA單倍型能增加小麥的粒寬和粒重，為最優(yōu)異的等位變異組合。

2.2.3 TaSus2-2B>基因等位變異與籽粒表型差異顯著性分析

分析結果表明， TaSus2-2B>等位變異對粒長和千粒重有顯著影響。 SUS2-2B-H>與 SUS2-2B-L單倍型材料的粒長(P<0.05)和千粒重(P<0.01)呈顯著或極顯著性差異，粒寬無顯著性差異(表2)。因此， SUS2-2B-H>單倍型能增加小麥的粒長和粒重，為優(yōu)異的等位變異。

2.2.4 變異組合與籽粒的表型差異顯著性及變異貢獻率分析

262份供試材料中出現(xiàn)了8種上述四個等位變異位點的變異組合，分別命名為Ⅰ～Ⅷ型變異組合(表3)。其中Ⅲ型組合出現(xiàn)頻次最多，為78次；Ⅶ型組合出現(xiàn)頻次最少，僅6次，故不參與比較。籽粒表型與變異組合差異顯著性分析結果表明，變異組合對粒寬無顯著影響，對粒長和千粒重影響顯著。Ⅳ型組合與Ⅱ、Ⅲ型組合的粒長(P<0.05)和千粒重(P<0.01)呈顯著或極顯著性差異，與Ⅴ、Ⅵ、Ⅷ型組合(P<0.01)的千粒重呈極顯著性差異，且粒長和千粒重都高于其他組合。Ⅲ型組合與Ⅳ、Ⅰ型組合的千粒重(P<0.01)呈顯著性差異，且粒長和千粒重都低于絕大多數(shù)組合?？梢耘袛啖粜徒M合可增加小麥粒長和粒重，為最優(yōu)組合；Ⅲ型組合可降低小麥粒長和粒重，為最差組合。

Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型組合均有兩種優(yōu)異等位變異，其中Ⅲ型的兩種優(yōu)異等位變異為 TaCwi-A1a>單倍型和TT單倍型，Ⅱ型為 TaCwi-A1a>單倍型和 Hap-6A-A>單倍型，Ⅳ型為 TaCwi-A1a>單倍型和 SUS2-2B-H>單倍型，但是Ⅲ、Ⅱ型的粒長(P<0.05)和千粒重(P<0.01)均顯著或極顯著低于Ⅳ型，可見 TaGW2-6A>基因編碼區(qū)和啟動子區(qū)等位變異對于籽粒表型的貢獻率均小于 TaSus2-2B 基因等位變異；Ⅴ型組合的優(yōu)異等位變異為 TaGW2-6A>基因TA和 SUS2-2B-H>單倍型，但是Ⅳ型的千粒重(P<0.01)極顯著高于Ⅴ型，可見 TaCwi-A1a>單倍型對于小麥粒重的增效功能大于 TaGW2-6A>基因TA變異組合。因此， TaGW2-6A>基因等位變異對于籽粒表型性狀的貢獻率最低。

表3 單倍型組合的表型差異顯著性分析Table 3 Correlation analysis of polymorphism combinations and kernel size

2.3 粒重基因變異組合在我國麥區(qū)的分布情況

在我國十個麥區(qū)中，除了青藏春冬麥區(qū)、長江中下游冬麥區(qū)及華南冬麥區(qū)外，其他七個麥區(qū)中Ⅲ型變異組合均占最大比例，Ⅳ型變異組合比例很小或沒有(東北春麥區(qū)無Ⅳ型變異組合)。青藏春冬麥區(qū)中Ⅳ型變異組合占最大比例，長江中下游麥區(qū)和華南冬麥區(qū)中Ⅱ型變異組合占最大比例，Ⅲ、Ⅳ型變異組合占比較小。十個麥區(qū)中西北麥區(qū)和北方冬麥區(qū)擁有全部8個變異組合，新疆冬春麥區(qū)和華南冬麥區(qū)變異組合類型相對較少，但也擁有5個。可見，Ⅲ型變異組合在我國十個麥區(qū)中均有分布且在大多數(shù)麥區(qū)中占比最高，除東北春麥區(qū)外其他麥區(qū)均擁有Ⅳ型變異組合，但Ⅳ型變異組合占比較低。各麥區(qū)的變異組合類型較為豐富。表4列出了來自我國十大麥區(qū)部分重要品種的相關信息。

表4 各麥區(qū)部分重要品種名稱及單倍型表型數(shù)據(jù)Table 4 Part of important varieties from each wheat zone and their genotype-phenotype data

3 討 論

近年來，隨著新型生物技術和比較基因組學的發(fā)展，很多小麥粒重相關基因已經被克隆[12]。本研究選取了最早克隆的三個粒重相關基因作為研究對象，發(fā)現(xiàn) TaCwi-A1>基因的 TaCwi-A1a>變異、 TaGW2-6A>基因的TA變異組合及 TaSus2-2B>基因的 SUS2-2B-H>變異為優(yōu)異的等位變異，這與前人的研究一致，再次驗證了這些變異對于籽粒表型性狀的增效作用。值得注意的是， TaCwi-A1>基因的 TaCwi-A1a>變異僅顯著增加了千粒重(P<0.05)，而對粒長和粒寬無顯著影響，這與劉永偉等[19]對黃淮麥區(qū)小麥籽粒表型的研究結果不一致，這種情況也發(fā)生在其他變異類型中，特別是 TaGW2-6A>基因編碼區(qū)的 Hap-6A-A>/ Hap-6A-G>等位變異對粒長、粒寬和千粒重均無顯著影響。除了供試材料不一樣外，一個很重要的原因可能是，材料中地方品種居多，整體遺傳多樣性高，導致單個粒重基因變異對于粒長、粒寬或者千粒重中某一項的效應被其他與籽粒表型有關的基因所掩蓋[22]。而這更加支持了對多個粒重基因等位變異綜合效應研究的必要性。目前已有小麥染色體上千粒重QTLs加性效應及互作的研究，這些QTL簇對不同環(huán)境下籽粒表型性狀的貢獻率也被報道[11]，這些優(yōu)異位點對于將分子標記輔助選擇用于小麥高產育種具有重要價值。本研究對重要的粒重基因加以具體的研究，所選材料多為地方品種，但是三個基因的變異組合對千粒重(P<0.01)有極顯著影響，可以判斷這三個基因對于小麥粒重的貢獻較大。另外，在本研究中 TaGW2-6A>基因等位變異的表現(xiàn)最為普通，對小麥粒重的貢獻率小于 TaCwi-A1>基因及 TaSus2-2B>基因。由于此結果是通過部分變異組合的定性比較得出的，所分析的材料總數(shù)較少，僅作為參考。

由于供試材料中地方品種較多而選育品種較少，在對我國十大麥區(qū)優(yōu)異基因變異組合頻率分布的研究中，得出了與前人單獨研究某個基因頻率分布時不一致的結果。前人在對我國麥區(qū) TaCwi-A1>基因、 TaGW2-6A>基因和 TaSus2-2B>基因頻率分布的研究中，普遍得出優(yōu)異變異經歷了較強的選擇，占比較高的結論[13，18-21]。但是，本研究中262份微核心材料中表現(xiàn)最差的Ⅲ型變異組合出現(xiàn)頻次最高，且在我國大多數(shù)麥區(qū)中占比最高，而表現(xiàn)最好的Ⅳ型變異組合出現(xiàn)頻次較低，且集中出現(xiàn)于青藏春冬麥區(qū)，其他麥區(qū)中出現(xiàn)很少甚至沒有出現(xiàn)?？梢姰敯讯鄠€基因綜合分析時，并未得出優(yōu)異基因組合占比較高的結果，相反最差基因組合的占比最高。因此，多個粒重基因變異組合的綜合效應應該作為育種中要考慮到的一個方面，我國各麥區(qū)的粒重基因變異組合還具有選擇潛力。

本研究在262份微核心材料中僅出現(xiàn)了8種變異組合，并且被認為應該為最優(yōu)異的 TaCwi-A1a>/TT/ Hap-6A-A>/SUS2-2B-H>組合并未出現(xiàn)。說明小麥的粒重育種還擁有巨大的育種潛力，如果利用分子標記輔助聚合育種實現(xiàn)這四種優(yōu)異變異的累加聚合，小麥的粒重及產量將可能實現(xiàn)較大的提高。因此，本研究對于加速小麥粒重育種具有重要的意義。本研究選取的三個重要的粒重基因對于小麥籽粒表型性狀的貢獻率較大，可以作為粒重育種的候選基因。此外，近幾年被報道的 TGW6>基因、 TaGS5>基因和 TaCYP78A3>基因等通過控制細胞分裂而影響小麥粒重[23 ]，為這些基因建立高通量分子檢測方法將為小麥粒重基因的分子輔助聚合育種提供了方法與材料依據(jù)。對重要的產量相關基因加以選擇與聚合，將成為未來小麥高產育種的一個重要方向。