156份小麥種質(zhì)資源的紋枯病抗性鑒定與評(píng)價(jià)

刁慧珊，梁邦平，李家創(chuàng)，郝冬冬，武 軍，趙繼新，楊群慧，陳新宏

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100)

小麥紋枯病是我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)江蘇、安徽、河南、山東和河北等麥區(qū)的主要土傳病害，主要是被禾谷絲核菌(Rhizoctoniacerealis)侵染引起，少數(shù)(<10%)是由于立枯絲核菌(R.solani) 侵染而引起[1-2]。病菌侵染宿主后，在宿主細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)展，并穿透毗鄰細(xì)胞的細(xì)胞壁向四周擴(kuò)展，進(jìn)一步破壞小麥的莖、葉鞘，從而阻礙營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸，造成小麥產(chǎn)量降低及糧食安全問(wèn)題[3-4]。2005年，810萬(wàn)hm2冬小麥?zhǔn)芎坦冉z核菌影響[5]。2006-2015年間，盡管采取了防治措施，小麥紋枯病造成的實(shí)際年均小麥產(chǎn)量損失為54.63萬(wàn)t，年均經(jīng)濟(jì)損失在10億元以上[6]。2017年，小麥紋枯病總體偏重發(fā)生，發(fā)生面積為866.67萬(wàn)hm2(http://www.agri.cn/V20/ZX/nyyw/201702/t20170216_5485112.htm)。因此，對(duì)小麥紋枯病進(jìn)行防控有著重要意義。噴施殺菌劑能有效減少小麥產(chǎn)量損失，然而，抗藥小種的出現(xiàn)易使對(duì)應(yīng)的寄主抗性增加，加大了防控大規(guī)模小麥紋枯病流行的難度。且隨著小麥拔節(jié)，殺菌劑擴(kuò)展到植株下部的難度隨之增加，使其有效性下降[7]。此外，殺菌劑的殘留對(duì)環(huán)境和作物均有害。而合理的耕作制度，如精耕、深耕、輪作等，不適用于大規(guī)模的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)?？刂菩←溂y枯病的根本方法是選育抗病品種，優(yōu)良種質(zhì)資源的鑒定和篩選則尤為重要。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外報(bào)道了數(shù)千份小麥種質(zhì)資源的紋枯病抗性鑒定結(jié)果[8-9]。這些材料大體上可分為國(guó)內(nèi)改良品種、農(nóng)家品種、國(guó)外引進(jìn)品種和小麥近緣種屬植物。其中，對(duì)紋枯病抗性較好的國(guó)內(nèi)改良品種有西農(nóng)9871、麗麥16等，農(nóng)家品種有紅蛐子、山紅麥等，國(guó)外引進(jìn)品種有FHB143、ARz和 CI12633等[7, 10]。小麥近緣種屬植物也是較好的紋枯病抗性資源庫(kù)[11-12]。然而，目前我國(guó)生產(chǎn)上推廣利用的小麥無(wú)高抗或免疫品種，且多高感紋枯病[13]，需要擴(kuò)寬鑒定材料范圍，如小麥近緣種屬和國(guó)外引進(jìn)材料等，從而獲得小麥紋枯病新抗源。此外，由于小麥對(duì)紋枯病的抗性屬于受多基因控制的典型數(shù)量性狀，容易受外界因素的影響，而被報(bào)道材料被鑒定的年份和評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)不盡相同，鑒定篩選的持續(xù)和鑒定方法的優(yōu)化有待加強(qiáng)[10， 14]。小麥紋枯病抗性鑒定方法主要有人工接種和自然病圃接種兩大類(lèi)，前者可靠性較高，但相對(duì)耗時(shí)、耗力，后者適用于大規(guī)模鑒定材料的初篩，但可靠性欠缺，需多年多點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)；人工接種當(dāng)前應(yīng)用比較廣泛的有表土接種法、溝撒病麥粒法、牙簽接種法和病麥粒接菌法[15]。其中，牙簽接種法接種壓力一致，減少了環(huán)境因素對(duì)試驗(yàn)的影響，穩(wěn)定性、重復(fù)性較好。本試驗(yàn)采取溫室牙簽接種法，對(duì)包括42份國(guó)內(nèi)改良品種、55份引進(jìn)美國(guó)小麥材料和59份小麥-華山新麥草后代共156份小麥材料進(jìn)行紋枯病抗性鑒定，以期篩選出紋枯病新抗源并在育種和生產(chǎn)上加以利用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

156份供試小麥材料包括42份國(guó)內(nèi)改良品種，55份美國(guó)小麥材料和59份小麥-華山新麥草后代材料，以揚(yáng)麥158作為感病對(duì)照。 小麥紋枯病菌種為強(qiáng)致病力菌株R0301，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.2 方 法

1.2.1 病菌接種

采用牙簽接菌法于溫室進(jìn)行接種。2015年對(duì)156份小麥材料進(jìn)行紋枯病抗性初步鑒定;2016年、2017年分別對(duì)篩選出的抗性較好的材料進(jìn)一步鑒定。具體操作步驟：將種子30 d春化處理后種植于溫室，每份小麥材料種3盆,每盆15株,在苗期(一般4～5葉期)用沾菌牙簽接種，于接種后30 d調(diào)查紋枯病病情。將對(duì)折并減去中段的牙簽(長(zhǎng)約1.5 cm)放入燒杯中浸泡24 h后，無(wú)菌操作移入接種R0301的PDA固體培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)至菌絲遍布牙簽后(通常2～3周)，放入4 ℃恒溫箱中備用。于小麥4～5葉期,用無(wú)菌鑷子夾取有菌牙簽接種，每個(gè)葉鞘嵌入1個(gè)有菌牙簽，用濕潤(rùn)的醫(yī)用脫脂棉纏繞，每盆材料接種10個(gè)單株。接種后噴霧保濕48 h，之后常規(guī)管理，每天噴水一次。

1.2.2 病情調(diào)查與評(píng)價(jià)

接種后30 d(通常為小麥乳熟期)調(diào)查小麥紋枯病溫室發(fā)病情況，病級(jí)及評(píng)價(jià)參考任麗娟等[16]的方法略有改動(dòng)。0級(jí):最外層葉鞘無(wú)病斑；1級(jí):只有最外層葉鞘有病斑；2級(jí):最外層到第二、第三葉鞘連續(xù)三層都有病斑；3級(jí)：最外層到第四、第五葉鞘連續(xù)五層都有病斑；4級(jí)：最外層到莖稈上都有病斑；5級(jí)：整株枯死。并根據(jù)下面的公式計(jì)算病情指數(shù)。

病情指數(shù)(DI)=(0×X0+1×X1+2×X2+3×X3+4×X4+5×X5)/(X0+X1+X2+X3+X4+X5)×5×100%，式中0 、1 、2 、... 5 分別表示相應(yīng)的病害等級(jí)，X0、X1、…、X5分別表示和病害等級(jí)相對(duì)應(yīng)的小麥植株數(shù)。

DI=0為免疫，0

根據(jù)李洪連等[17]提出的相對(duì)抗病性評(píng)價(jià)方法，用相對(duì)抗病指數(shù)作為病害評(píng)級(jí)指標(biāo)。相對(duì)抗病指數(shù)(RRI)=1-所測(cè)品種病情指數(shù)/發(fā)病最重品種病情指數(shù)。

免疫(I):RRI為1.00；高抗(HR):0.8≤RRI<1.00；抗(R):0.6≤RRI<0.8；中抗(MR):0.4≤RRI<0.6；中感(MS):0.2≤RRI<0.4；感(S):RRI<0.2。

1.2.3 小麥農(nóng)藝性狀調(diào)查

將初步鑒定后篩選出的紋枯病抗性材料分別于2015年10月和2016年10月于西北農(nóng)林科技大學(xué)官村試驗(yàn)基地播種，每份材料均種兩行，行距20 cm，行長(zhǎng)1.5 m, 設(shè)3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)地土壤保持肥力均勻。田間記載幼苗習(xí)性、株高、成熟期等表型性狀。成熟期后，每份材料隨機(jī)選取10個(gè)單株，烘干，進(jìn)行室內(nèi)考種，包括株高、單株穗數(shù)、穗長(zhǎng)、小穗數(shù)、穗粒數(shù)、粒質(zhì)、千粒重共7個(gè)性狀。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007和SPSS Statistics 22進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 156份材料的紋枯病抗性初篩

經(jīng)過(guò)初步鑒定，從156份材料中篩選出63份對(duì)小麥紋枯病抗性表現(xiàn)較好的材料，占總供試材料的40.38%，包括17份國(guó)內(nèi)改良品種，25份引進(jìn)美國(guó)小麥材料，21份小麥-華山新麥草后代材料，國(guó)內(nèi)改良品種、引進(jìn)美國(guó)小麥材料和小麥-華山新麥草后代材料分別占相應(yīng)材料的40.47%、45.45%和35.59%。

2.2 63份材料對(duì)紋枯病的抗性評(píng)價(jià)

對(duì)63份初篩抗小麥紋枯病較好的材料進(jìn)行進(jìn)一步抗性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，63份抗紋枯病較好的材料在2017年(50.39%)的平均病情指數(shù)高于2016年(42.20%)；2016與2017年國(guó)內(nèi)改良品種、引進(jìn)美國(guó)小麥材料、小麥-華山新麥草后代材料的病情指數(shù)分別為45.57%與50.23%、45.11%與47.74%、36.00%與53.69%,前兩種材料病情指數(shù)在兩年間的差異不顯著。小麥-華山新麥草后代材料的病情指數(shù)在兩年間差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明其受環(huán)境因素影響較大，抗性遺傳不穩(wěn)定，大部分材料不宜作為抗性供源。

兩年病情指數(shù)平均值分布范圍為28.33%～70.33%，總平均值為46.30%，63份材料中無(wú)免疫和高抗紋枯病材料。兩年平均病情指數(shù)達(dá)到中抗和中抗以上水平的一共44份，其中，國(guó)內(nèi)改良品種10份，發(fā)病最重，兩年平均病情指數(shù)為47.90%，達(dá)到抗病水平的材料有2份，占11.76%，分別是輪選166和農(nóng)大2011；引進(jìn)美國(guó)小麥材料17份，發(fā)病程度其次，兩年平均病情指數(shù)為46.43%，達(dá)到抗病水平的材料有7份，占28.00%，分別是Dup09L-plot483、NIN09L-7、Dup09L-plot682、Hitch、TVT09L-9、RPN09L-37和Dup09L-plot517；小麥-華山新麥草后代17份，發(fā)病程度最輕，兩年病情指數(shù)平均為44.85%，達(dá)到抗病水平的材料有6份，占28.57%，分別是Y-83-2、Y-83-3、Y-83-1、H-6-11-1、Y-58-1和Y-126。

小麥-華山新麥草后代材料Y55-2在2016和2017年病情指數(shù)平均為93.33%，用于這63份材料的相對(duì)抗病指數(shù)的計(jì)算。根據(jù)相對(duì)抗病指數(shù)，參與兩年抗性鑒定試驗(yàn)的材料中也無(wú)免疫和高抗紋枯病材料,兩年表現(xiàn)穩(wěn)定中抗及以上的種質(zhì)材料共36份(表1)，占63份初篩材料的57.14%。36份材料中，引進(jìn)美國(guó)小麥材料有16份(44.44%)，其中，有2份材料兩年表現(xiàn)穩(wěn)定抗病，分別是NIN09L-7和Dup09L-plot483；國(guó)內(nèi)改良品種有10份(27.78%)，其中，輪選166兩年表現(xiàn)穩(wěn)定抗??；小麥-華山新麥草后代材料有10份(27.78%)，有2份材料兩年表現(xiàn)穩(wěn)定抗病，分別是Y-83-1和Y-83-3。說(shuō)明這5份材料抗性較為穩(wěn)定，可以作為紋枯病新的抗源材料。

2.3 抗病材料的農(nóng)藝性狀及其主成分分析

對(duì)兩年經(jīng)相對(duì)病情指數(shù)評(píng)價(jià)為中抗及中抗以上的36份材料進(jìn)行部分農(nóng)藝性狀調(diào)查，結(jié)果如表2。這7個(gè)農(nóng)藝指標(biāo)中，粒質(zhì)和單株穗數(shù)變異系數(shù)較大，分別為44.72%、42.62%，變化范圍分別為1～4、9～61，說(shuō)明這兩個(gè)指標(biāo)選擇潛力大。千粒重、穗粒數(shù)、株高、穗長(zhǎng)和小穗數(shù)的變異系數(shù)分別為22.54%、21.53%、13.24%、12.88%和11.17%，均高于10%，進(jìn)一步說(shuō)明這36份材料的農(nóng)藝性狀差異較大，多樣性較高。7個(gè)指標(biāo)變幅各異，根據(jù)單一指標(biāo)判斷均會(huì)產(chǎn)生不同結(jié)果，需通過(guò)主成分分析綜合評(píng)價(jià)。

對(duì)各農(nóng)藝性狀進(jìn)行主成分分析，根據(jù)特征值大于1，提取到3個(gè)主成分。第一主成分貢獻(xiàn)率為27.91%，其性狀特征值中貢獻(xiàn)率較高的是單株穗數(shù)、粒質(zhì)和穗長(zhǎng)；第二主成分貢獻(xiàn)率為24.01%，其性狀特征值中貢獻(xiàn)率較高的是穗粒數(shù)和千粒重；第三主成分貢獻(xiàn)率為20.69%，其性狀特征值中貢獻(xiàn)率較高的是株高和粒質(zhì)。結(jié)果(表3)發(fā)現(xiàn)，小麥-華山新麥草的綜合農(nóng)藝性狀最好，平均總得分為3.73，總得分較高的有Y-139(9.94)、Y-83-1(5.45)和Y-83-3(5.21)，可以直接用于育種。引進(jìn)美國(guó)小麥材料其次，平均總得分為-0.72，NIN09L-13(總得分6.33)和Dup09L-Plot-517(總得分5.52)農(nóng)藝性狀好。國(guó)內(nèi)改良品種的綜合農(nóng)藝性狀最差，平均總得分為-2.40，徐麥1108(總得分2.04)農(nóng)藝性狀較好。

表1 兩年表現(xiàn)穩(wěn)定抗和中抗紋枯病的材料Table 1 Wheat cultivars with stable and moderate-resistance to sharp eyespot in two years

表2 兩年表現(xiàn)穩(wěn)定抗和中抗材料的農(nóng)藝性狀分析Table 2 Analysis of agronomic characters of materials with stable and moderate-resistance in two years

表3 各農(nóng)藝性狀的主成分析Table 3 Analysis of accumulated contribution of principal components for agronomic traits

2.4 抗病材料農(nóng)藝性狀的聚類(lèi)分析

在主成分分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)農(nóng)藝性狀的不同，對(duì)36份材料進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果(圖1)表明，在歐氏距離10時(shí)，可將這36份材料分為4大類(lèi)。第一大類(lèi)包括23份材料，以小麥-華山新麥草后代和國(guó)內(nèi)改良品種為主，其可以細(xì)分為兩類(lèi)，一類(lèi)包括Dup09L-Plot-481、Dup09L-Plot-483、Dup09L-Plot-517、Dup09L-Plotb-682、09-33-8-1-1、09-39-3-1-2-2、09-44-5-1-1-1、H-6-11-1、H-1-8-1-3-1、Y-139、Y-58-1、Y-73-1、Y-83-1、Y-83-3共14份材料，這類(lèi)材料單株穗數(shù)多(31)，粒質(zhì)較硬(1)，穗長(zhǎng)偏長(zhǎng)(10.8 cm)，穗粒數(shù)較多(70)，千粒重較高(37.43 g)，株高偏高(82 cm)；另一類(lèi)包括新麥18、 新麥26、 賽德麥1、 輪選166 、 徐麥1108、 珍麥3號(hào)、 農(nóng)大2011、 周麥1、 圣麥109共9份材料，這類(lèi)材料單株穗數(shù)較少(16)，粒質(zhì)偏半硬質(zhì)(3)，穗長(zhǎng)偏短(9.9 cm)，穗粒數(shù)較多(70)，千粒重高(48.04 g)、株高較矮(71 cm)。第二大類(lèi)包括10份材料，以引進(jìn)美國(guó)小麥材料為主，可細(xì)分為兩類(lèi)，一類(lèi)包括Dup09L-Plot-615、Dup09L-Plot-617、Dup09L-Plot-618、Dup09L-Plot-632、NIN09L-7、IDRD09L-30、RPN09L-37、Hitch共8份材料，這類(lèi)材料單株穗數(shù)較多(26)，粒質(zhì)偏半硬質(zhì)(2)，穗長(zhǎng)較短(9.44 cm)，穗粒數(shù)少(45)，千粒重偏低(29.06 g)，株高偏矮(75 cm)；另一類(lèi)包括TVT09L-1和煙19，單株穗數(shù)少(13)，粒質(zhì)偏半硬質(zhì)(3)，穗長(zhǎng)偏長(zhǎng)(10.25 cm)，穗粒數(shù)較少(49)，千粒重較高(41.70 g) 、株高較高(90 cm)。第三大類(lèi)材料包括NIN09L-13和Wahoo，單株穗數(shù)(56)明顯多于其余材料，穗長(zhǎng)較長(zhǎng)(11.50 cm)。第四大類(lèi)材料TVT09L-9，株高(118 cm)明顯高于其余材料。

圖1 36份小麥材料農(nóng)藝性狀聚類(lèi)分析Fig.1 Cluster analysis of 36 wheat materials based on agronomic characters

3 討 論

小麥對(duì)紋枯病的抗性是一種涉及微效多基因的可遺傳數(shù)量抗性，基因之間存在加性互作，其作用強(qiáng)度因不同品種而異[2，18]。本研究中，不同來(lái)源的小麥種質(zhì)對(duì)紋枯病的抗性存在差異，國(guó)內(nèi)改良品種抗性最差，引進(jìn)美國(guó)小麥材料其次，小麥-華山新麥草后代材料抗性最強(qiáng)。

抗性數(shù)量位點(diǎn)容易受環(huán)境因素的影響[19-20]。為減少環(huán)境因素對(duì)試驗(yàn)的影響，本試驗(yàn)采用溫室牙簽接種法。溫室的環(huán)境相對(duì)外界環(huán)境，易于控制，不容易感染其他病害；牙簽被嵌入葉鞘內(nèi)側(cè)，盡可能排除了土壤中其他微生物的影響，接種壓力較一致，重復(fù)性高[21-22]。本試驗(yàn)中，供試材料苗期莖稈較為強(qiáng)壯，也為牙簽接種法提供了條件。被接菌的植株需要被挖出來(lái)進(jìn)行病情調(diào)查，相對(duì)耗時(shí)耗力，但結(jié)果的可靠性也相對(duì)較高[22]。本試驗(yàn)中，國(guó)內(nèi)改良品種、引進(jìn)美國(guó)小麥材料的病情指數(shù)在兩年間的差異不顯著，表明牙簽法受環(huán)境因素影響小且重復(fù)性高。而小麥-華山新麥草后材料兩年發(fā)病情況一致性差，可能是由于部分小麥-華山新麥草后代材料還沒(méi)有穩(wěn)定遺傳。引進(jìn)相對(duì)病情指數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià)，能篩選到重復(fù)性較好、抗性較穩(wěn)定的抗源[10]。本試驗(yàn)根據(jù)相對(duì)病情指數(shù)篩選到5份抗病材料，遠(yuǎn)少于根據(jù)平均病情指數(shù)獲得的達(dá)到抗病水平的材料份數(shù)(15份)，可用于紋枯病抗性育種。

主成分分析通過(guò)降維，用少數(shù)幾個(gè)綜合因子代表先前的多數(shù)變量，盡可能多地反映先前變量的信息量[23]。用主成分分析評(píng)價(jià)小麥農(nóng)藝性狀，能更真實(shí)地反映小麥綜合農(nóng)藝性狀[24]。綜合考慮這些材料的抗性與農(nóng)藝性狀，引進(jìn)美國(guó)小麥材料中抗源較多，抽穗期偏晚，綜合農(nóng)藝性狀較差，育種上不宜直接利用，必須改良后再加以利用。這與顏 偉等[25]、任麗娟等[16]和蔣彥婕等[10]的鑒定結(jié)果相近。小麥-華山新麥草后代材料中有好的抗源材料，綜合農(nóng)藝性狀好，可以直接利用。輪選166、NIN09L-7抗性好，但綜合農(nóng)藝性狀較差，必須加以改良后才能利用。Dup09L-plot483抗性好，綜合農(nóng)藝性狀較好，可以間接利用。Y-83-1、Y-83-3抗性和農(nóng)藝性狀皆較好，可以作為小麥紋枯病抗病育種較好的種質(zhì)資源。Y-83-1和Y-83-3為小麥-華山新麥草后代材料，鑒于當(dāng)前華山新麥草的紋枯病抗性未被報(bào)道過(guò)，下一步，需將這兩份材料和其親本進(jìn)行對(duì)比，探究其抗病機(jī)理。