合浦珠母貝幼蟲(chóng)培育的餌料優(yōu)化研究

鄧正華, 陳明強(qiáng), 王 雨, 黃桂菊, 于 剛，吳開(kāi)暢, 李有寧

( 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300 )

合浦珠母貝(Pinctadafucata)又稱(chēng)馬氏珠母貝(P.martensii)，是培育海水珍珠的主要暖水性海洋雙殼貝類(lèi)，主要分布于中國(guó)、日本、印度、澳大利亞和東南亞等熱帶和亞熱帶的沿海國(guó)家，在中國(guó)分布于廣東、廣西和海南等沿海[1-2]。聞名遐邇的“南珠”就是以合浦珠母貝培育的珍珠，該珍珠養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)為部分沿海地區(qū)支柱產(chǎn)業(yè)之一[3]，已形成一條完整的產(chǎn)業(yè)鏈。國(guó)內(nèi)外對(duì)合浦珠母貝的研究主要集中在遺傳育種[4]、苗種繁育[5]、攝食生理[6]、免疫學(xué)[7]及分子生物學(xué)[8-11]等方面。雖自1965年就已成功開(kāi)展了合浦珠母貝的人工繁育研究[4]，但幼蟲(chóng)培育的死亡率較高，苗種培育效果極不穩(wěn)定。目前，合浦珠母貝的苗種供應(yīng)仍依賴(lài)親貝的大繁殖量，提高人工育苗的幼蟲(chóng)成活率勢(shì)在必行。在其他海洋雙殼貝類(lèi)幼蟲(chóng)培育中，通過(guò)分析單胞藻營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和幼蟲(chóng)營(yíng)養(yǎng)需求[12-16]，調(diào)控單胞藻投喂量和投喂頻率[17-18]，以及尋找其他替代餌料[19]可提高幼蟲(chóng)生長(zhǎng)速率和成活率。但是，并非所有的單胞藻都能被幼蟲(chóng)攝食和消化[20-21]，充分了解投喂餌料的消化、吸收率是餌料選擇的基礎(chǔ)。單胞藻胞徑、消化難易及生化組成等直接影響其能否作為幼蟲(chóng)培育的餌料，尤其是消化性直接影響幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)和成活率。Martínez-Fernández等[20]用10種單胞藻投喂企鵝珍珠貝(Pteriasterna)幼蟲(chóng)，僅有5種能被攝食，2種能被消化；Lora-Vilchis等[22]分別用10種單胞藻投喂卡塔琳娜扇貝(Argopectenventricosus)幼蟲(chóng)，僅有7種能被攝食，3種能被消化；鄧正華等[21]用9種單胞藻投喂黃邊糙鳥(niǎo)蛤(Trachycardiumflavum)幼蟲(chóng)，其更易攝食胞徑較小的球形單胞藻，細(xì)胞裸露無(wú)細(xì)胞壁的單胞藻更易被消化。筆者用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察了不同日齡合浦珠母貝幼蟲(chóng)對(duì)苗種培育中常用的10種單胞藻的攝食與消化情況，給幼蟲(chóng)單獨(dú)與混合投喂易攝食、易消化不同密度的單胞藻，比較幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)與成活狀況，為幼蟲(chóng)培育選擇合適的單胞藻餌料及投喂策略。

1 材料與方法

1.1 材料

2齡合浦珠母貝親貝殼長(zhǎng)約6 cm，取自中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所熱帶水產(chǎn)研究開(kāi)發(fā)中心陵水試驗(yàn)基地。挑選性腺飽滿(mǎn)的個(gè)體，清除表面附著物，刷洗干凈，置于陰涼處陰干刺激3 h，移入育苗水泥池中流水刺激，使其自然產(chǎn)卵、受精。24 h后受精卵發(fā)育至D形幼蟲(chóng)，用400目篩絹網(wǎng)濾出、清洗，再移至育苗水泥池中培養(yǎng)，密度為5 個(gè)/mL。幼蟲(chóng)培育期間日換水30%～50%，8:00和18:00混合投喂湛江叉鞭金藻(Dicrateriazhanjiangensis)與綠色巴夫藻(Pavlovaviridis)，投喂量為1×103～5×103個(gè)/mL。幼蟲(chóng)培育期間水溫(27.03±1.22) ℃、pH 8.20±0.03、鹽度28.45±1.20。

以上兩種藻類(lèi)在頂部直徑90 cm、底部直徑80 cm、高74 cm的玻璃缸纖維桶內(nèi)，添加F/2營(yíng)養(yǎng)液[23]，自然光照(0～5000 lx)下一次性培養(yǎng)。用于幼蟲(chóng)攝食和消化試驗(yàn)的10種單胞藻(表1)，在5 L錐形瓶中添加F/2營(yíng)養(yǎng)液，于5000 lx(0 D∶24 L)光照下密封培養(yǎng)，每日搖晃錐形瓶2次，每5～7 d重新接種單胞藻。試喂時(shí)，10種單胞藻均處于快速生長(zhǎng)期。

表1 用于飼喂幼蟲(chóng)的10種單胞藻胞徑及主要特征

1.2 方法

1.2.1 幼蟲(chóng)對(duì)單胞藻的攝食與消化

受精后第2、8、14、18、22 d，自育苗池中取一部分幼蟲(chóng)，用孔徑為47 μm的篩絹網(wǎng)過(guò)濾清洗后轉(zhuǎn)移至過(guò)濾海水中饑餓12 h，然后放入分別裝有400 mL密度為105個(gè)/mL 10種單胞藻液的10個(gè)500 mL燒杯中，幼蟲(chóng)密度為5個(gè)/mL。幼蟲(chóng)在含有單胞藻水體中攝食1 h后取出，在phenix-ph 50顯微鏡下觀(guān)察幼蟲(chóng)對(duì)單胞藻的攝食情況。已攝食的幼蟲(chóng)，用孔徑為47 μm的篩絹網(wǎng)過(guò)濾清洗后轉(zhuǎn)移至過(guò)濾海水中。在幼蟲(chóng)攝食后的第1、2、4 h，每次、每組至少觀(guān)察20個(gè)幼蟲(chóng)胃內(nèi)單胞藻的消化情況。

1.2.2 幼蟲(chóng)攝食不同單胞藻的成活率

在5 個(gè)/mL幼蟲(chóng)的水泥池中，給幼蟲(chóng)投喂3組餌料：湛江叉鞭金藻、綠色巴夫藻及兩種單胞藻數(shù)量比為1∶1的混合藻，每組餌料均設(shè)置3個(gè)平行。每日6:00、12:00、18:00和24:00投喂，投喂量為1×103～5×103個(gè)/mL，日換水30%～50%。每隔幾日自培育池中取一部分幼蟲(chóng)，測(cè)量殼長(zhǎng)(n=30)，受精后第22 d，用體積為1 L的采水器以9點(diǎn)法(培育池的8個(gè)頂角和中心)采集9 L水樣，混合，自混合水樣中取一定體積水樣(幼蟲(chóng)個(gè)數(shù)大于500個(gè))，滴入2滴NaClO2使幼蟲(chóng)沉淀，收集沉淀幼蟲(chóng)集中至1 mL浮游生物計(jì)數(shù)框中，用顯微鏡檢測(cè)計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)幼蟲(chóng)成活率。

1.2.3 單胞藻投喂量對(duì)幼蟲(chóng)成活率的影響

在20 L培育桶中，以5個(gè)/mL的密度培養(yǎng)幼蟲(chóng)，每日8:00和18:00分別向培育桶內(nèi)幼蟲(chóng)投喂2×103、20×103個(gè)/mL和40×103個(gè)/mL的湛江叉鞭金藻，每種密度均設(shè)置3個(gè)平行，培育桶日換水1次。幼蟲(chóng)培育至受精后第6 d，用篩絹網(wǎng)采集幼蟲(chóng)，在顯微鏡下測(cè)量幼蟲(chóng)殼長(zhǎng)(n=30)，計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)幼蟲(chóng)成活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 21統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，用LSD法多重比較各組間數(shù)值的差異顯著性(P<0.05)；用Toup View圖像分析軟件對(duì)顯微鏡下放大后的幼蟲(chóng)進(jìn)行拍照和測(cè)量大??；用Photoshop CS5對(duì)圖像進(jìn)行處理；用Origin 9.1做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼蟲(chóng)對(duì)10種單胞藻的攝食與消化

幼蟲(chóng)對(duì)10種單胞藻的攝食、消化和空胃狀態(tài)見(jiàn)圖1。幼蟲(chóng)剛攝入單胞藻時(shí)，胃內(nèi)可見(jiàn)完整的單胞藻；當(dāng)單胞藻消化時(shí)，胃內(nèi)單胞藻呈彌散狀；單胞藻完全消化排泄時(shí)，胃空；消化盲囊吸收單胞藻營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其顏色與單胞藻相同。

不同日齡幼蟲(chóng)對(duì)10種單胞藻的攝食與消化結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，各日齡幼蟲(chóng)均能攝食小球藻、微綠球藻、湛江叉鞭金藻、綠色巴夫藻和球等鞭金藻；對(duì)亞心形扁藻、三角褐指藻和小新月菱形藻均不攝食，隨著幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)，僅見(jiàn)部分或極少數(shù)幼蟲(chóng)攝食少量的杜氏鹽藻和牟氏角毛藻。小球藻和微綠球藻很難被消化，在幼蟲(chóng)胃內(nèi)未經(jīng)完全消化就以完整細(xì)胞排出，湛江叉鞭金藻、綠色巴夫藻和球等鞭金藻則較易消化。隨著生長(zhǎng)，幼蟲(chóng)可攝食更大胞徑的單胞藻，消化排泄能力也逐漸增強(qiáng)。

圖1 合浦珠母貝幼蟲(chóng)對(duì)單胞藻的攝食、消化與空胃Ⅰ.胃中單胞藻細(xì)胞全部完整；Ⅱ.胃中單胞藻部分或全部裂解；Ⅲ.幼蟲(chóng)對(duì)單胞藻剛好完全消化排泄.

注：Ⅰ.胃中單胞藻完整； Ⅱ.胃中單胞藻部分或全部裂解； Ⅲ.單胞藻剛好被完全消化排泄； NO.未攝食； PAR.部分幼蟲(chóng)攝食； FEW.極少數(shù)幼蟲(chóng)攝食.

2.2 不同種類(lèi)及密度單胞藻對(duì)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)與成活的影響

培育至受精后22 d時(shí)，攝食混合餌料的幼蟲(chóng)殼長(zhǎng)與成活率分別為(195.91±19.00) μm、(11.33±0.98)%，攝食綠色巴夫藻的幼蟲(chóng)殼長(zhǎng)與成活率分別為(179.23±16.60) μm、(10.32±0.99)%，攝食湛江叉鞭金藻的幼蟲(chóng)殼長(zhǎng)與成活率分別為(172.14±13.32) μm、(7.34±0.98)%(圖2)，表明混合餌料組幼蟲(chóng)的殼長(zhǎng)和成活率均顯著高于兩種單胞藻單獨(dú)投喂(P<0.05)，攝食綠色巴夫藻組幼蟲(chóng)殼長(zhǎng)和成活率又顯著高于攝食湛江叉鞭金藻的幼蟲(chóng)(P<0.05)。

幼蟲(chóng)培育中，湛江叉鞭金藻投喂量分別為2×103、20×103個(gè)/mL和40×103個(gè)/mL，培育至受精后第6 d時(shí)，隨投喂單胞藻密度的增加，幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)速率和成活率均顯著降低(P<0.05)(圖3)。

圖2 單獨(dú)投喂湛江叉鞭金藻、綠色巴夫藻和二者等比例混合投喂時(shí)幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)與成活狀況不同小寫(xiě)字母表示組間差異顯著(P<0.05).

圖3 合浦珠母貝幼蟲(chóng)攝食不同密度的湛江叉鞭金藻時(shí)的生長(zhǎng)與成活狀況同一顏色柱狀圖上方不同字母表示差異顯著(P<0.05).

3 討 論

3.1 幼蟲(chóng)對(duì)不同單胞藻的攝食與消化

本試驗(yàn)中，各日齡幼蟲(chóng)均能攝食小球藻、微綠球藻、湛江叉鞭金藻、綠色巴夫藻和球等鞭金藻，不攝食亞心形扁藻、三角褐指藻和小新月菱形藻，18日齡后部分或極少數(shù)幼蟲(chóng)攝食杜氏鹽藻和牟氏角毛藻。這與企鵝珍珠貝幼蟲(chóng)[20]、黃邊糙鳥(niǎo)蛤幼蟲(chóng)[21]、扇貝幼蟲(chóng)[22]、糙海參(Holothuriascabra)幼蟲(chóng)[24]和珠母貝(Pinctadamargaritifera)幼蟲(chóng)[25]等對(duì)單胞藻的攝食選擇類(lèi)似。這些結(jié)果表明，幼蟲(chóng)更容易攝食胞徑較小且呈圓形的單胞藻。隨著生長(zhǎng)，幼蟲(chóng)攝食能力逐漸增強(qiáng)[26]，因此在18日齡后有部分和極少數(shù)的幼蟲(chóng)能夠攝食胞徑較大的杜氏鹽藻和牟氏角毛藻。角毛藻富含海洋無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲(chóng)正常生長(zhǎng)發(fā)育所需的必需脂肪酸[27-29]，已在棘皮動(dòng)物和雙殼貝類(lèi)幼蟲(chóng)培育中作為主要餌料或搭配餌料使用[25,30-31]。但在合浦珠母貝幼蟲(chóng)培育中并不適口，牟氏角毛藻呈方形或長(zhǎng)條形，雖規(guī)格僅為5 μm×7 μm，但其生有4根長(zhǎng)達(dá)20～30 μm的角毛，阻礙了幼蟲(chóng)的正常攝食[20,24,32]。胞徑較小的單胞藻比胞徑較大的單胞藻更易被幼蟲(chóng)攝食，這與稚貝和成貝的攝食結(jié)果正好相反[33-34]。稚貝和成貝主要以鰓濾食，隨著單胞藻規(guī)格的增大從鰓絲漏掉的幾率也就降低，因此對(duì)胞徑較大單胞藻的攝食率高于胞徑較小的單胞藻[35]。而幼蟲(chóng)階段主要靠纖毛的不斷擺動(dòng)使單胞藻隨水流進(jìn)入幼蟲(chóng)口溝而被攝食[26]。單胞藻胞徑大于幼蟲(chóng)口溝時(shí)則不能流入，不規(guī)則或長(zhǎng)條形的單胞藻只有與口溝存在一定的恰當(dāng)角度才能順利進(jìn)入口溝，因此幼蟲(chóng)更易攝食胞徑較小、形狀呈球形、表面光滑的小球藻、微綠球藻、湛江叉鞭金藻、綠色巴夫藻和球等鞭金藻等。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，幼蟲(chóng)對(duì)湛江叉鞭金藻、綠色巴夫藻、球等鞭金藻和杜氏鹽藻的消化率較高，但卻較難消化小球藻和微綠球藻。這與糙海參幼蟲(chóng)[24]、扇貝幼蟲(chóng)[22]、企鵝珍珠貝幼蟲(chóng)[36]和美洲牡蠣(Crassostreavirginica)幼蟲(chóng)[37]對(duì)類(lèi)似單胞藻的消化結(jié)果相同。湛江叉鞭金藻、綠色巴夫藻、球等鞭金藻和杜氏鹽藻無(wú)細(xì)胞壁，在幼蟲(chóng)胃內(nèi)經(jīng)機(jī)械作用和消化酶的作用下，易被裂解、消化并排泄；而同屬綠藻門(mén)的小球藻和微綠球藻具有一層纖維素細(xì)胞壁，很難被裂解和消化。未被消化的單胞藻在幼蟲(chóng)胃內(nèi)微絨毛的擺動(dòng)和胃自身收縮的條件下逐漸被排出。

3.2 不同投喂策略對(duì)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)與成活的影響

培養(yǎng)期間，湛江叉鞭金藻與綠色巴夫藻混合投喂時(shí)，合浦珠母貝幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)速率和成活率均顯著高于兩種單胞藻單獨(dú)投喂(P<0.05)，而綠色巴夫藻組又顯著(P<0.05)高于湛江叉鞭金藻組。就單胞藻混合投喂對(duì)幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)和成活高于單獨(dú)投喂的效果，Martínez-Fernández等[12,15]在珠母貝幼蟲(chóng)培育中得出相同的結(jié)論。通常認(rèn)為，多種單胞藻混合投喂避免了單一種類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)不均衡，提高了餌料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，更利于幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)和成活。然而，并非所有的餌料種類(lèi)搭配對(duì)幼蟲(chóng)培育的生長(zhǎng)和存活影響皆如此。Tang等[38]比較了球等鞭金藻及球等鞭金藻分別與杜氏鹽藻、亞心形扁藻和三角褐指藻混合投喂對(duì)文蛤(Meretrixmeretrix)幼蟲(chóng)生長(zhǎng)與存活的影響，發(fā)現(xiàn)3個(gè)混合藻組幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)和成活并不比單獨(dú)投喂球等鞭金藻提高顯著，其原因可能與其選擇搭配的單胞藻種類(lèi)有關(guān)。杜氏鹽藻、亞心形扁藻和三角褐指藻與球等鞭金藻混合投喂時(shí)，幼蟲(chóng)對(duì)近乎球形且胞徑較小的球等鞭金藻攝食效率高于其他3種單胞藻，混合投喂時(shí)，幼蟲(chóng)選擇性的攝食球等鞭金藻，未能達(dá)到混合藻營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)互補(bǔ)，提高其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的效果。因此，在進(jìn)行單胞藻混合搭配投喂時(shí)，應(yīng)充分考慮單胞藻的形狀、胞徑大小、消化程度及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成等因素，保障培育的幼蟲(chóng)正常生長(zhǎng)，提高成活率。

在一定密度范圍內(nèi)，隨著單胞藻投喂密度的增加，幼蟲(chóng)生長(zhǎng)速率和成活率均顯著降低。這與投喂餌料密度過(guò)高導(dǎo)致蛤仔(Venerupiscorrugata)幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)速率與成活率[39]、文蛤的同化率[40]降低情況相似。鄧正華等[21,41]將黃邊糙鳥(niǎo)蛤幼蟲(chóng)和珠母貝幼蟲(chóng)放入105個(gè)/mL的單胞藻液中攝食1 h，發(fā)現(xiàn)幼蟲(chóng)在高密度單胞藻水體中一次性攝食過(guò)多，胃內(nèi)單胞藻在微絨毛和胃自身收縮條件下，未經(jīng)完全消化即完整排出體外。同時(shí)幼蟲(chóng)為了維持其對(duì)水的交換和自身浮游狀態(tài)，其纖毛一直維持著擺動(dòng)和攝食狀態(tài)。因此，在幼蟲(chóng)培育中，幼蟲(chóng)一次性攝入過(guò)多單胞藻時(shí)，攝入的單胞藻未能充分被消化利用，也影響了幼蟲(chóng)的生長(zhǎng)和存活。