波紋唇魚雄激素受體基因的克隆與表達(dá)分析

鄒文慧，單鱗茜，韓 邦，駱 劍，齊 鑫，林浩然,

( 1.海南大學(xué) 海洋學(xué)院，南海海洋資源利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?570228； 2.中山大學(xué)，水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究所，廣東省水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物良種繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510275 )

波紋唇魚(Cheilinusundulatus)為大型珊瑚礁魚類，屬硬骨魚綱、鱸形目、隆頭魚科、唇魚屬[1]，在我國主要分布于南海與東海南部，海南萬寧、陵水等海域以及香港、臺(tái)灣諸島。波紋唇魚存在天然的性逆轉(zhuǎn)現(xiàn)象，種群性別結(jié)構(gòu)影響其性逆轉(zhuǎn)的發(fā)生[2]，在波紋唇魚野生群體中大部分成年個(gè)體都是雌魚，群體中少數(shù)體形較大、年齡較長的個(gè)體才發(fā)育為雄魚。此外，由于波紋唇魚顏色艷麗、體形巨大、肉質(zhì)細(xì)嫩且營養(yǎng)價(jià)值高，其售價(jià)持續(xù)上漲[3]。在巨大的經(jīng)濟(jì)利益驅(qū)使下，波紋唇魚野生資源遭到嚴(yán)重破壞，瀕臨滅絕。

雄激素在脊椎動(dòng)物的性別分化、性成熟和精子發(fā)生中起重要作用[4]，其通過雄激素受體(ar)激活下游信號(hào)通路，從而行使其功能。雄激素受體屬于核受體超家族成員[5]，具有3個(gè)主要結(jié)構(gòu)域，包括N端超變量轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、高度保守的DNA結(jié)合區(qū)域和C端配體結(jié)合區(qū)域。小鼠(Musmusculus)中，突變雄激素受體基因產(chǎn)生對(duì)雄激素不敏感的表現(xiàn)型缺失[6-7]。據(jù)此，雄激素受體在雄性性別分化和發(fā)育過程中起重要作用。在魚類中，斑馬魚(Daniorerio)雄激素受體基因在精巢支持細(xì)胞中高度表達(dá)，而魚類的支持細(xì)胞與精原細(xì)胞的發(fā)育有關(guān)，這表明斑馬魚雄激素受體基因在精原細(xì)胞的增殖和分化中起重要作用。雄激素受體基因在鰻鱺(Anguillajaponica)精巢早期發(fā)育階段的高度表達(dá)也說明，雄激素受體在雄性魚類性別分化和發(fā)育過程中起重要的作用。有研究表明，雄激素受體拮抗劑氟他米處理成熟雄性黑頭呆魚(Pimephalespromelas)，引起抗苗勒氏管激素的表達(dá)下降，據(jù)此，可進(jìn)一步說明雄激素受體在調(diào)節(jié)魚類精巢發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用。此外，雄激素受體在雌性生殖功能中也扮演著非常重要的角色。在鰻鱺卵巢中，雄激素11-KT的靶細(xì)胞主要是濾泡細(xì)胞和產(chǎn)卵層的上皮細(xì)胞，進(jìn)而可以推測(cè)，雄激素作為卵子發(fā)生直接調(diào)控因子，通過雄激素受體在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。在澳洲鰻鱺(A.australis)中，雄激素11-KT可以通過雄激素受體對(duì)卵黃卵母細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)行調(diào)控，從而刺激卵巢中甘油三酯的積累并增大卵母細(xì)胞的直徑[8]。

波紋唇魚作為性別分化研究的良好材料，又以肉質(zhì)鮮美和較高的觀賞性而得到人們的青睞，所以具有很高的研究價(jià)值。并且，目前尚無人工繁殖的波紋唇魚，所以其人工繁殖研究非常重要。筆者以波紋唇魚為研究對(duì)象，首次克隆了雄激素受體基因的cDNA序列全長，并進(jìn)行序列分析，與其他魚類雄激素受體基因氨基酸序列比對(duì)，并構(gòu)建進(jìn)化樹，Realtime PCR分析波紋唇魚雄激素受體基因mRNA在13種組織中的表達(dá)量，為進(jìn)一步研究波紋唇魚內(nèi)分泌生理奠定基礎(chǔ)，也為該魚生殖調(diào)控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集及RNA提取

試驗(yàn)所用的波紋唇魚取自海南三亞剛漁排網(wǎng)箱人工暫養(yǎng)的野生個(gè)體，共3尾2齡雌性，共2.7 kg。解剖，取前腦、中腦、后腦、垂體、下丘腦、卵巢、肝臟、心臟、脾臟、前腸、后腸、腎臟、肌肉13種組織，立即放入液氮中，用Trizol試劑(invitrogen公司)提取總RNA，提取的RNA通過瓊脂糖電泳進(jìn)行鑒定后于冰箱-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 雄激素受體 cDNA的分子克隆

1.2.1 波紋唇魚雄激素受體基因核心區(qū)cDNA的克隆

取1 μg的性腺RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。根據(jù)波紋唇魚雄激素受體基因的轉(zhuǎn)錄組序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)中間片段的引物ar-mid-F和ar-mid-R(表1)。以性腺cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：10×Buffer 2 μL，dNTP 2 μL，cDNA 1 μL，Taq DNA polymerase 0.2 μL，ddH2O 12.8 μL，正反引物各1 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。純化目的片段、連接到PGEM-T載體，轉(zhuǎn)染大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上12 h后挑菌，驗(yàn)證，測(cè)序，于美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站上比對(duì)。

1.2.2 cDNA末端快速擴(kuò)增

用SmartTM-race cDNA Amplification Kit合成可用于擴(kuò)增3′和5′端SmartTM-race-ready cDNA。以核心區(qū)序列為模板設(shè)計(jì)5′RACE-PCR 和3′RACE-PCR 套式引物3′-ar-RACE-F1、3′-ar-RACE-F2、5′-ar-RACE-R1、5′-ar-RACE-R2，通用引物為UPM和NUP(表1)。反應(yīng)體系及反應(yīng)程序如上所述。純化目的片段、連接到PGEM-T載體，轉(zhuǎn)染大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基上12 h后挑菌，驗(yàn)證，測(cè)序，于美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站上比對(duì)。

1.3 序列測(cè)定和分析

使用ORFFinder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)尋找ORF；信號(hào)肽預(yù)測(cè)采用Sinnal P 4.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)；用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)在線程序進(jìn)行蛋白結(jié)構(gòu)域分析；運(yùn)用DNAstar軟件，將所得雄激素受體基因的cDNA序列轉(zhuǎn)化為氨基酸序列，與美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站中的雄激素受體基因氨基酸資源進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)生分析，采用鄰接法(1000次運(yùn)算)運(yùn)用Mega 7.0軟件，進(jìn)行多重比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 雄激素受體在波紋唇魚中的組織表達(dá)

取各組織1 μg，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用Primer 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)定量引物ar-real-F和ar-real-R以及內(nèi)參引物βactin-real-F，βactin-real-R和EF1α-real-F，EF1α-real-R，引物序列見表1。將cDNA稀釋10倍，作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR，體系為：cDNA 0.5 μL，SYBR 5 μL，正反引物各0.2 μL，H2O 4.1 μL。

2 結(jié) 果

2.1 波紋唇魚雄激素受體基因的克隆及系統(tǒng)發(fā)生分析

利用RT-PCR擴(kuò)增得到的雄激素受體基因的全長為3514 bp，其中包括111 bp的5′UTR，1104 bp的3′UTR(去除poly A尾)以及2268 bp的ORF。經(jīng)BLAST比對(duì)，獲得的雄激素受體基因的片段與其他魚類的雄激素受體基因有很高的相似性，表明這段序列為波紋唇魚的雄激素受體基因序列。將所獲得的序列提交到美國國立生物技術(shù)信息中心，獲得登錄號(hào)為MG383647。

波紋唇魚雄激素受體基因cDNA編碼755個(gè)氨基酸，用Singal P程序分析發(fā)現(xiàn)無信號(hào)肽酶切位點(diǎn)，預(yù)測(cè)其蛋白分子量約為84.7 ku，等電點(diǎn)約為6.83。用BLASTP分析雄激素受體基因的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)它的3個(gè)結(jié)構(gòu)域：轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(TAD，AA1-393)、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD，AA394-475)和配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(LBD，AA510-754)，進(jìn)一步分析顯示該序列還含有大部分物種中均含有的P-box(GSCKV)和D-box(ASKND)特殊結(jié)構(gòu)，其均位于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，此外，在配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域區(qū)還有1個(gè)八肽的亮氨酸拉鏈區(qū)(圖1)。

表1 波紋唇魚雄激素受體基因克隆和表達(dá)所用的引物

采用BioEdit軟件進(jìn)行多重序列比較分析發(fā)現(xiàn)，波紋唇魚雄激素受體基因的氨基酸序列在各物種之間的相似性較高，波紋唇魚雄激素受體基因與貝氏隆頭魚(Labrusbergylta)、西氏擬隆頭魚(Pseudolabrussieboldi)和歐洲舌齒鱸(Dicentrarchuslabrax)的雄激素受體基因的相似性分別為85.0%、82.5%和79.5%(表2)。將所得的雄激素受體基因序列與美國國立生物技術(shù)信息中心中16個(gè)物種的雄激素受體序列進(jìn)行同源性比對(duì)，利用Mega 7.0軟件采用鄰接法和最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。兩種系統(tǒng)發(fā)育樹分析均表明，波紋唇魚與隆頭魚科魚類貝氏隆頭魚和西氏擬隆頭魚聚為一小支，與其他魚類聚為一大支，而哺乳類聚為一支(圖2～3)。各物種雄激素受體序列在GenBank的注冊(cè)號(hào)分別為：西氏擬隆頭魚(ADI24924.1)，歐洲舌齒鱸(AAT76433.1)，大黃魚(Pseudosciaenacrocea)(NP_001290296.1)，絨須石首魚(Micropogoniasundulatus)(AAU09477.1)，斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides)(ADQ43815.1)，真鯛(Chrysophrysmajor)(AB017158.1)，金頭鯛(Sparusaurata)(AEO13404.1)，雀鯛(Stegastespartitus)(XP_008301461.1)，黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)(AAO61694.1)，三刺魚(Gasterosteusaculeatus)(AB545869.1)，貝氏隆頭魚(XP_020485876.1)，人(Homosapiens)(M20132.1)，小鼠(NM_013476.4)，斑馬魚(NP_001076592.1)，尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)(NM_001279615.1)。

表2 波紋唇魚雄激素受體氨基酸序列與其他已知物種的雄激素受體基因氨基酸序相似性分析

2.2 組織表達(dá)分布

通過熒光定量PCR的方法檢測(cè)雄激素受體基因在波紋唇魚的前腦、中腦、后腦、垂體、下丘腦、心臟、肝臟、卵巢、脾臟、腎臟、前腸、后腸、肌肉13種組織中的表達(dá)量。結(jié)果表明，波紋唇魚雄激素受體基因在這13種組織中均有表達(dá)，在腎臟中表達(dá)量最高，而在前腸中的表達(dá)量最少(圖4)。

圖1 波紋唇魚雄激素受體基因的cDNA序列及推測(cè)的氨基酸序列第一段黑色部分為轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，藍(lán)色部分為DNA結(jié)合域，紅色部分為配體結(jié)合域，黃色區(qū)域?yàn)镻-box和D-box，綠色部分為八肽的亮氨酸拉鏈區(qū). 終止密碼子以*號(hào)表示.

圖2 16種動(dòng)物雄激素受體基因mRNA序列鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖4 雄激素受體基因在波紋唇魚各組織中的表達(dá)

3 討 論

3.1 波紋唇魚雄激素受體基因的克隆及系統(tǒng)發(fā)生分析

本試驗(yàn)克隆了波紋唇魚雄激素受體基因的全長cDNA序列，全長為3514 bp，其中包括111 bp的5′UTR，1104 bp的3′UTR(去除poly A尾)以及2268 bp的ORF，其蛋白分子量約為84.7 ku，等電點(diǎn)約為6.83。經(jīng)BLAST對(duì)比，其與貝氏隆頭魚、西氏擬隆頭魚和歐洲舌齒鱸的雄激素受體基因的相似性分別為85.0%、82.5%和79.5%，可以確定其為波紋唇魚的雄激素受體基因。與其直系同源的雄激素受體相似，波紋唇魚雄激素受體的氨基酸序列同樣包含了3個(gè)特征結(jié)構(gòu)域，即轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，DNA結(jié)合域和配體結(jié)合域。轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的低同源性被認(rèn)為是構(gòu)成許多直系同源雄激素受體基因主要結(jié)構(gòu)差異的原因，同時(shí)也是導(dǎo)致不同組織分布的原因，為研究的重點(diǎn)[9]。高度保守的DNA結(jié)合域有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)[10]，這2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)分別包含P-box(GSCKV)(參與雄激素受體與其配體反應(yīng)元件的結(jié)合)以及D-box(ASKND)(參與識(shí)別反應(yīng)元件half-sites的間距)。同源性較不保守的配體結(jié)合域呈螺旋狀結(jié)構(gòu)，參與配體受體結(jié)合作用，在其C端末發(fā)現(xiàn)的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，對(duì)受體的二聚體化作用很重要[11]。序列分析表明，波紋唇魚雄激素受體基因的DNA結(jié)合域和配體結(jié)合域高度保守。

系統(tǒng)發(fā)育分析表明，魚類和哺乳類位于2個(gè)明顯不同的分支，克隆得到的波紋唇魚的雄激素受體基因位于魚類分支中，再次證明克隆得到的片段為波紋唇魚的雄激素受體基因。此外，一些魚類同時(shí)存在2種雄激素受體基因，推測(cè)其可能是全基因組復(fù)制—退化—補(bǔ)償過程所致[12]。即原始雄激素受體基因的復(fù)制推測(cè)起來可能發(fā)生在魚類第2次基因組復(fù)制(2R)時(shí)[13-15]，于是產(chǎn)生了雄激素受體α基因和雄激素受體β基因。在進(jìn)化過程中，雄激素受體α基因或者雄激素受體β基因丟失。可能因?yàn)樵陂L時(shí)間的進(jìn)化中，其中1個(gè)基因會(huì)以特異性世系的方式丟失[16]。

3.2 波紋唇魚雄激素受體基因的組織分布

波紋唇魚雄激素受體基因在各組織中的熒光定量PCR結(jié)果表明，波紋唇魚的雄激素受體基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)，只是表達(dá)量有差異，說明雄激素受體在波紋唇魚中具有廣泛的生理作用。波紋唇魚的雄激素受體基因在腎臟中表達(dá)量最高，而在前腸中的表達(dá)量最低。研究表明，含有2種雄激素受體基因亞型的魚類，其組織表達(dá)模式也存在很大的差異，如虹鱒(Oncorhynchusmykiss)，雄激素受體α基因在垂體、腦、卵巢、精巢、肝臟和心臟中均有表達(dá)，而雄激素受體β基因只在垂體、腦、精巢和卵巢中有表達(dá)，鰻鱺的雄激素受體α基因在脾臟、腎臟、心臟、肌肉、肝臟、精巢、卵巢和腦中有表達(dá)，但雄激素受體β基因只在肌肉、脾臟和精巢中有表達(dá)[17]。以上研究表明，雄激素受體α基因在許多組織中均有表達(dá)，只是表達(dá)量有差異，在一些重要組織中具有較高的表達(dá)水平，而雄激素受體β基因只在個(gè)別組織中表達(dá)。只含有1種雄激素受體基因的魚類存在相似的組織表達(dá)模式，即在各個(gè)組織中均有表達(dá)，如南方鲇(Silurusmeridionalis)在腦、垂體、鰓、心臟、肝臟、腸、脾臟、性腺、腎臟和肌肉中均有表達(dá)，其中雄魚在肝臟中表達(dá)量較高；對(duì)雄性半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)的研究發(fā)現(xiàn)，雄激素受體基因在各組織中均有表達(dá)，其中腎臟的表達(dá)量最高[18]。而波紋唇魚雄激素受體基因的表達(dá)模式與只含有1種雄激素受體基因魚類的表達(dá)模式相似，其中腎臟中表達(dá)量最高，推測(cè)其可能只含有1種雄激素受體基因。此外，波紋唇魚的雄激素受體基因在肝臟中的表達(dá)量較高，與之前的研究結(jié)果一致，提示魚類中的雄激素可能是通過性激素受體調(diào)控卵黃蛋白原的合成[19]。除此之外，波紋唇魚的雄激素受體基因在卵巢中的表達(dá)量也較高，說明雄激素受體在雌性的生殖功能中也起著重要的作用。