甘肅省定西市馬鈴薯瘡痂病新病原Streptomyces galilaeus的分離、鑒定及生物學特性研究

崔凌霄 楊成德 魏立娟 薛莉 張俊蓮

摘要

對甘肅省定西市安定區(qū)的馬鈴薯瘡痂病病原進行了分離、鑒定和生物學特性研究。結(jié)果表明，菌株5T-1具有較強致病性，菌落表面呈灰色，有金屬光澤，平均直徑為4.68 mm，可產(chǎn)生黃褐色素，孢子圓形或圓柱形，孢子絲松散，革蘭氏染色呈陽性。5T-1的16S rDNA序列與加利利鏈霉菌Streptomyces galilaeus菌株的相似度為99%，結(jié)合形態(tài)特征將菌株5T-1鑒定為Streptomyces galilaeus，為甘肅省新報道病原菌。菌株5T-1生長最適溫度為30℃，最適光照條件為全黑暗，最適pH為8.5，最佳碳源和氮源分別為肌醇和天冬氨酸。該研究結(jié)果為甘肅省馬鈴薯瘡痂病診斷和綜合防治提供了依據(jù)。

關鍵詞

馬鈴薯瘡痂病; 病原; 16S rDNA序列分析; 鑒定; 生物學特性

中圖分類號：

S 435.32

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018109

Isolation， identification and biological characterization of Streptomyces galilaeus，

a new pathogen of potato scab in Dingxi City， Gansu Province

CUI Lingxiao YANG Chengde WEI Lijuan XUE Li ZHANG Junlian2

（1. Laboratory of Biocontrol Engineering of Crop Pests and Diseases in Gansu Province， College of

Plant Protection， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070， China; 2. Gansu Key Lab of

Crop Improvement & Germplasm Enhancement， Lanzhou 730070， China）

Abstract

The pathogen of potato scab from Anding District of Dingxi City in Gansu Province was isolated and identified， and its biological characteristics were also determined. The results showed that the strain 5T-1 was highly pathogenic. The colony was gray with a metallic luster and the average diameter of 4.68 mm， which could produce yellow brown pigment. The spores were round or cylindrical and spores silk was loose. Gram staining is positive. The similarity of 16S rDNA sequence of 5T-1 to that of Streptomyces galilaeus was 99%. Combining with the morphological characteristics， the strain 5T-1 was identified as S.galilaeus. It is a newly reported pathogen in Gansu Province. The optimal temperature for strain growth was 30℃. The optimal illumination conditions were darkness and the optimal pH value was 8.5. The best carbon source and nitrogen source were inositol and aspartic acid， respectively. The results provide a basis for the diagnosis and integrated control of potato scab in Gansu Province.

Key words

potato scab; pathogen; 16S rDNA sequence analysis; identification; biological characteristics

馬鈴薯為繼玉米、小麥和水稻之后的世界第四大糧食作物[1]，分布廣，種植便捷，產(chǎn)量高，是備受人們喜愛的經(jīng)濟作物之一。甘肅省是國內(nèi)馬鈴薯種植大省，尤其定西馬鈴薯更是世界聞名。但是，隨著種植面積擴大，重茬嚴重，致土傳病害嚴重發(fā)生，特別是馬鈴薯瘡痂病近年來成為甘肅省定西市薯塊主要病害之一。馬鈴薯瘡痂病在世界各地馬鈴薯種植區(qū)普遍發(fā)生[2]，其在薯塊上形成褐色木栓化病斑，發(fā)病嚴重時，病斑成片，嚴重影響薯塊品質(zhì)和商品性。據(jù)報道，引起馬鈴薯瘡痂病的病原為鏈霉菌，國內(nèi)外報道的種主要有Streptomyces scabies、S.acidiscabies、S.turgidiscabies、S.europaeiscabiei、S.bobili、S.reticuliscabiei和S.griseus等[2-6]，其中S.scabies發(fā)現(xiàn)最早，分布最廣。我國不同省份報道的瘡痂鏈霉菌存在差異，內(nèi)蒙古自治區(qū)有S.scabies、S.galilaeus和S.bobili[7]，甘肅省有S.scabies和S.griseus[8]，黑龍江省有S.scabies、S.turgidiscabies和S.acidiscabies[9]。近年來，不斷有新的瘡痂致病種被發(fā)現(xiàn)，說明馬鈴薯瘡痂病致病菌分布復雜且存在多樣性，但有關S.galilaeus在甘肅省引起馬鈴薯瘡痂病未見報道，且該種與內(nèi)蒙古報道的種在生物學特性等方面是否一致也需要進一步證實。因此，本研究對分離自甘肅省定西市安定區(qū)馬鈴薯瘡痂病新病原S.galilaeus進行形態(tài)觀察及16S rDNA鑒定，并對其生物學特性進行了測定，以期為該病害的診斷和綜合防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試馬鈴薯瘡痂病病薯采自甘肅省定西市安定區(qū)。燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OMA）：燕麥片30 g、瓊脂18 g和蒸餾水1 000 mL;胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）：胰蛋白胨15 g、大豆蛋白胨5 g、氯化鈉5 g和蒸餾水1 000 mL;水瓊脂培養(yǎng)基（WA）：18 g瓊脂和蒸餾水1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離和保存

將甘肅省定西市安定區(qū)具有馬鈴薯瘡痂病典型癥狀的病薯用自來水沖洗干凈，無菌解剖刀切取帶有瘡痂病斑的塊莖病健交界處5 mm×5 mm×5 mm的小組織塊，無菌條件下，用0.1%升汞表面消毒20 s，無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸取多余水分，移至燕麥瓊脂培養(yǎng)基（OMA）平板上，每皿4塊，置于32℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，挑取組織塊周圍的菌落劃線，置于相同條件下純化，所得純化菌株編號，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測定

對分離到的菌株采用小薯片法、蘿卜片法和離體薯塊接種法進行致病性測定，具體方法參考文獻[6]進行。

1.2.3 病原菌形態(tài)學及生物學特性

病原菌分別接種于OMA平板，于32℃下培養(yǎng)5 d后觀察培養(yǎng)性狀。對OMA平板上活化培養(yǎng)18～24 h后的病原菌進行革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)，并在顯微鏡下拍照。將燕麥培養(yǎng)基上32℃培養(yǎng)7 d的病原菌，置于不同溫度、光照、pH、碳源和氮源等條件下分別培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測量10個單菌落直徑，計算菌落平均直徑，用SPSS 19.0軟件分析并確定其最佳生長條件。

1.2.4 16S rDNA序列分析

DNA提?。喝? mL在TSB中培養(yǎng)48 h的菌懸液，加入2 mL離心管中，室溫12 000 r/min離心1 min，棄上清液，收集菌體。向菌體沉淀中加入200 μL溶菌酶溶液，37℃水浴30 min （每10 min顛倒混勻1次）至混合液澄清，再加入20 μL proteinase K溶液混勻后加220 μL緩沖液GB，振蕩15 s，70℃水浴10 min，溶液應變清澈，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁水珠，再加入220 μL無水乙醇，充分振蕩混勻15 s，再簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁水珠。將上一步所得溶液和絮狀沉淀均加入吸附柱中，12 000 r/min離心30 s，棄廢液，將吸附柱放入收集管中，向吸附柱中分別加入500 μL緩沖液GD和600 μL漂洗液PW，每次離心30 s，之后再離心2 min，棄廢液，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液，后將吸附柱轉(zhuǎn)入離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100 μL洗脫緩沖液TE，室溫放置2～5 min，12 000 r/min離心2 min得到DNA產(chǎn)物，并將其收集到1.5 mL離心管中，置于-20℃保存。

PCR擴增：采用鏈霉菌16S rDNA通用擴增引物，引物由武漢金開瑞生物工程有限公司合成。引物序列27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR反應體系為25 μL：1492R 2 μL、27F 2 μL、DNA 2 μL、ddH2O 19 μL。 PCR反應條件為：94℃預變性1 min;94℃變性30 s，48℃退火30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán);最后72℃延伸8 min。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

將擴增出的16S rDNA片段送武漢金開瑞生物工程有限公司測序。將所得序列校對后，在NCBI的GenBank中進行BLAST比對，選取與各菌株相似性高的鏈霉菌菌株的16S rDNA序列，用MEGA 7.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確其分類地位。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0、MEGA 7.0和Excel 2010等軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘡痂病菌的分離和致病性測定

2.1.1 病原菌的分離

將采集的具有瘡痂典型癥狀的馬鈴薯，按照不同病斑表現(xiàn)癥狀進行分類編號，平狀病斑為P，凸狀病斑為T，凹狀病斑為A，通過組織分離和劃線純化共分離到20株分離物，依次編號為：3A2-2、3P1-1、3P2-1、3P3-4、4A-7、4A-16、4A-1前、4A-3前、4P-2、4P-3、4P-8、5A-1、5T-1、5P-1、5P-6、5P-7、61-6、62-3、62-4和62-5等。

2.1.2 致病性測定

采用小薯片法和蘿卜片法對分離到的20株分離物進行致病性測定，結(jié)果表明，菌株5T-1菌餅接種到小薯片和蘿卜片上，72 h后，發(fā)病率分別為100%和80% （表1），觀察到小薯片和蘿卜片表面變褐（圖1）。采用離體薯塊接種法，結(jié)果表明菌株5T-1能使薯塊發(fā)病率達100% （表1），接種處出現(xiàn)明顯的褐色病斑（圖1），70 d后病斑面積擴大，并且根據(jù)柯赫氏法則再次分離到菌株5T-1。以上三種方法證明分離到的菌株5T-1具有致病性，并且對照沒有表現(xiàn)出發(fā)病癥狀，說明菌株5T-1為甘肅省馬鈴薯瘡痂病的病原菌。

圖1 馬鈴薯瘡痂病菌菌株5T-1的致病性測定

Fig.1 Pathogenicity determination of isolate 5T-1 of potato scab pathogen

表1 馬鈴薯瘡痂病菌菌株5T-1致病性統(tǒng)計

Table 1 Statistics of pathogenicity for the isolate 5T-1 of potato scab pathogen

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 形態(tài)學特征

菌株5T-1的菌落為圓形，表面呈灰色，有金屬光澤，菌落平均直徑為4.68 mm，孢子絲松散，孢子圓形或圓柱形。在OMA培養(yǎng)基上菌落灰色，有黃褐色素產(chǎn)生，革蘭氏染色呈陽性（圖2）。

圖2 馬鈴薯瘡痂病菌菌株5T-1形態(tài)特征

Fig.2 Morphology of isolate 5T-1 of potato scab pathogen

2.2.2 病原菌16S rDNA序列分析

采用鏈霉菌16S rDNA通用引物，對已提取菌株5T-1的DNA進行PCR擴增，擴增出16S rDNA片段長度約1 500 bp，并將該16S rDNA擴增產(chǎn)物送武漢金開瑞生物公司測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對，選擇同源性大于98%的菌株和已報道的從馬鈴薯上分離的瘡痂鏈霉菌典型菌株Streptomyces galilaeus（EU8417141）、S.bottropensis（KR476476.1）、S.diastatochromogenes（AB026218.1）、S.turgidiscabies（KU975443.1）、S.griseus（EF192235.1）和S.scabiei（AY207603.1），用ClustalX軟件進行多重比較和用MEGA 7.0軟件中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，從甘肅省馬鈴薯瘡痂病薯上分離到的致病菌株5T-1與S.galilaeus（EU841714.1）菌株親緣關系最近（圖3），序列相似度為100%，結(jié)合形態(tài)學特征，將其鑒定為加利利鏈霉菌Streptomyces galilaeus。

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建的馬鈴薯瘡痂病菌系統(tǒng)發(fā)育樹

Fig.3 Phylogenetic tree of potato scab pathogen on the basis of 16S rDNA sequence

2.3 菌株5T-1生物學特性測定

2.3.1 溫度對加利利鏈霉菌5T-1生長的影響

加利利鏈霉菌5T-1在溫度為30℃條件下培養(yǎng)，7 d后，菌落直徑達4.56 mm，顯著高于其他溫度（P<0.05）（圖4），即該菌株最適生長溫度為30℃。

圖4 溫度對加利利鏈霉菌菌株5T-1生長的影響

Fig.4 Effect of temperature on mycelial growth of

Streptomyces galilaeus isolate 5T-1

2.3.2 光照對加利利鏈霉菌5T-1生長的影響

加利利鏈霉菌5T-1在32℃、全黑暗條件下培養(yǎng)，7 d后，菌落直徑達5.18 mm，顯著高于其他光照條件（P<0.05） （圖5），L∥D=12 h∥12 h的光照條件下，其生長狀況最差，即該菌最適光照條件為全黑暗。

圖5 光照條件對加利利鏈霉菌菌株5T-1生長的影響

Fig.5 Effect of light condition on mycelial growth of

Streptomyces galilaeus isolate 5T-1

2.3.3 pH對加利利鏈霉菌5T-1生長的影響

將加利利鏈霉菌5T-1置于不同pH條件下，32℃培養(yǎng)。結(jié)果表明，該菌在pH 4～10.5范圍內(nèi)均可生長，其中pH 6.5～9范圍內(nèi)生長較好，且顯著高于其他pH條件（P<0.05）。7 d后，pH為8.5時該菌菌落直徑最大，達5.53 mm （圖6）。因此，該菌在偏堿的環(huán)境下生長良好，最適生長pH為8.5。

2.3.4 碳源對加利利鏈霉菌5T-1生長的影響

將加利利鏈霉菌5T-1置于不同碳源條件下，32℃培養(yǎng)。結(jié)果表明，該菌在供試碳源培養(yǎng)基上均可生長，其中在果糖培養(yǎng)基上生長較差，第7天時菌落直徑僅為2.93 mm，當碳源為肌醇和甘露醇時，菌落生長速度最快，第7天時菌落直徑分別達5.56 mm和4.81 mm，顯著高于其他供試碳源（P<0.05），表明該菌可以利用多種碳源，并且最佳碳源為肌醇，其次為甘露醇（圖7）。

圖6 pH對加利利鏈霉菌菌株5T-1的生長影響

Fig.6 Effect of pH value on mycelial growth of

Streptomyces galilaeus isolate 5T-1

圖7 碳源對加利利鏈霉菌菌株5T-1生長的影響

Fig.7 Effect of C-source on mycelial growth of Streptomyces galilaeus isolate 5T-1

圖8 氮源對加利利鏈霉菌菌株5T-1生長的影響

Fig.8 Effect of N-source on mycelial growth of

Streptomyces galilaeus isolate 5T-1

2.3.5 氮源對加利利鏈霉菌5T-1生長的影響

將加利利鏈霉菌5T-1置于不同氮源條件下，32℃培養(yǎng)。結(jié)果表明，該菌在天冬氨酸和組氨酸培養(yǎng)基上生長速度較快，第7 天時菌落直徑分別為3.32 mm和2.2 mm，當?shù)礊榈鞍彼岷屠野彼釙r，菌落生長速度顯著低于天冬氨酸和組氨酸（P<0.05），第7天時菌落直徑僅為1.33 mm和1.11 mm，但均可生長，表明該菌可以利用多種氮源，并且最佳氮源為天冬氨酸（圖8）。

3 結(jié)論與討論

迄今為止，國內(nèi)外對馬鈴薯瘡痂病病原研究報道很多，尤其國外研究較為深入，已報道的馬鈴薯瘡痂病病原菌種類有20余種[9]，大部分為鏈霉菌屬，其中S.scabies[10]，S.acidiscabies[2，11]和S.turgidiscabies[12]分布最為廣泛。國內(nèi)已報道的也有10余種，且存在地理差異，甘肅目前有S.scabies和S.griseus兩種病原菌[8]。研究普遍認為鏈霉菌的種類受種植環(huán)境和氣候因素影響較大，其分布存在明顯的地域性，不同種植區(qū)域間病原菌種類不同[13]。本文主要對甘肅省定西市馬鈴薯瘡痂病薯的病原進行分離、致病性測定和鑒定，確定5T-1為致病菌株，并通過形態(tài)特征及16S rDNA序列分析，將其鑒定為加利利鏈霉菌Streptomyces galilaeus，該菌引起甘肅省馬鈴薯瘡痂病為首次報道。

加利利鏈霉菌5T-1生長的最適溫度為30℃，與馬鈴薯瘡痂病在25～30℃溫度范圍內(nèi)易發(fā)病且發(fā)病嚴重的報道[14]一致。有關馬鈴薯瘡痂病病原光照條件的研究未見報道，本研究結(jié)果表明該菌最適光照條件為全黑暗，半光照條件對其生長有一定抑制作用，此與瘡痂病發(fā)生于土壤中，全黑暗的條件相符。馬鈴薯瘡痂病病菌在不同pH培養(yǎng)基上生長情況存在差異，pH在6～10范圍內(nèi)菌株均可生長，最適生長pH為8.5，與文獻報道的鏈霉菌更適合在堿性條件下生長[13]一致;當pH<5時，該菌生長速度慢。因此，酸性土壤可減輕馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生。加利利鏈霉菌5T-1能在含甘露醇的培養(yǎng)基上生長，且生長較好，與已報道的該菌不能利用甘露醇為碳源的結(jié)果[15]不一致，其原因可能是與菌株的自身特性及適應性有關。研究表明，該菌可以利用多種碳源和氮源，并且最佳碳源為肌醇和甘露醇，32℃培養(yǎng)7 d后，菌落直徑分別達5.56 mm和4.81 mm;最佳氮源為天冬氨酸，32℃培養(yǎng)7 d后，菌落直徑為3.32 mm。

本研究僅對甘肅省定西市安定區(qū)的馬鈴薯瘡痂病病原進行了研究，有關甘肅省其他地方可能存在的病原還有待進一步研究。

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（責任編輯： 楊明麗）