異硫氰酸烯丙酯的農(nóng)用活性與應用研究進展

李迎賓 曹永松 羅來鑫 張治萍 李健強

摘要

異硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate，AITC）是十字花科植物的組成型代謝產(chǎn)物之一，關于其天然抗菌殺蟲活性，以及在人類醫(yī)學、農(nóng)業(yè)、食品等領域的應用已有大量研究。本文重點對AITC的制備、農(nóng)用活性及殘留、安全性及作用機制研究等方面進行綜述，以期為AITC在農(nóng)業(yè)中的開發(fā)應用提供理論參考和技術支撐。

關鍵詞

異硫氰酸烯丙酯; 抗菌活性; 農(nóng)用活性; 作用機制

中圖分類號：

S 436.6

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018324

Research progresses on the anti-microbial activity and

application of allyl isothiocyanate in agriculture

LI Yingbin， CAO Yongsong， LUO Laixin， ZHANG Zhiping， LI Jianqiang

（College of Plant Protection， Beijing Key Laboratory of Seed Disease Testing and

Control （BKL-SDTC）， China Agricultural University， Beijing 100193， China）

Abstract

Allyl isothiocyanate， as an important constructive metabolite from cruciferous plants， has a broad biological activity and has been widely studied and applied in the fields of human medicine， agriculture， food science，et al. This review summarized the agricultural bioactivity and application of allyl isothiocyanate， including the preparation of AITC， agricultural activity， residue， safety and mechanism. The purpose of this paper is to provide more theoretical and technical support for the development and application of AITC in agricultural production.

Key words

allyl isothiocyanate; biological activity; agricultural activity; mechanism of AITC

依賴化學農(nóng)藥控制農(nóng)作物病蟲害具有悠久的歷史[1]。熏蒸劑作為合成化學農(nóng)藥的一種，在防控土傳、倉儲、采后病蟲害及食品保鮮等領域具有較為廣泛的應用。隨著人們消費水平及對食品安全的重視程度的提高，研究開發(fā)高效、無毒、無殘留的病蟲害防治措施及食品保鮮手段備受關注和重視。1937年Walker等報道十字花科蕓薹屬植物，如芥菜、甘藍中的硫代葡萄糖苷（glucosinolates，簡稱GSLs）的降解產(chǎn)物異硫氰酸酯類化合物（isothiocyanates，簡稱ITCs）具有天然抗菌活性[2]和廣譜滅生性[3]，其中異硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate，AITC）作為主要降解產(chǎn)物，對多數(shù)植物病原真菌[4]、細菌[5]、線蟲及昆蟲[6]具有活性。同時，對一些人類致病菌，如大腸桿菌Escherichia coli、鼠傷寒沙門氏桿菌Salmonella typhimurium、綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa、副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus、幽門螺旋桿菌Helicobacter pylori、念珠菌屬Candida sp.等同樣具有生物活性[7]。除此之外，AITC在抗癌、心肌保護及神經(jīng)保護等方面的效果和作用也受到關注[8-9]。

1 異硫氰酸烯丙酯及其制備工藝

1.1 異硫氰酸烯丙酯概述

異硫氰酸烯丙酯（AITC，俗稱為辣根素）是一類廣泛存在于辣根、芥菜和山葵等十字花科蔬菜中的天然含硫次生代謝物，是ITCs類物質(zhì)的主要種類;其在人類醫(yī)學、食品和農(nóng)業(yè)領域具有重要的應用價值，基于ITCs類物質(zhì)所申請的部分專利及農(nóng)藥登記報道見表1。

表1 國際上關于ITCs類物質(zhì)在相關領域申請專利及登記情況

Table 1 Application and registration of ITCs in the world

辣根素的前體為存在于植物液泡中的GSLs物質(zhì)，一旦將植物組織破碎，GSLs便在黑芥子酶的催化作用下水解[10]。不同十字花科植物GSLs水解產(chǎn)物不同。Jiang等采用GC-MS方法，共檢測出我國辣根中含有的9種揮發(fā)性ITCs物質(zhì)，名稱及含量分別為異硫氰酸異丙酯（isopropyl isothiocyanate，isopropyl ITC，含量0.1%）、異硫氰酸烯丙酯（AITC，含量78.4%）、異硫氰酸丁酯（butyl isothiocyanate，butyl ITC，含量0.1%）、3-丁烯基異硫氰酸酯（3-butenyl isothiocyanate，3-butenyl ITC，含量1.5%）、2-異硫氰酸戊酯（2-pentyl isothiocyanate，2-pentyl ITC，含量2.1%）、異硫氰酸苯酯（phenyl isothiocyanate，phenyl ITC，含量0.1%）、3-（甲基硫代）丙基硫代異氰酸酯（3-methylthiopropyl isothiocyanate，3-methyl ITC，含量0.3%）、異硫氰酸芐酯（benzyl isothiocyanate，benzyl ITC，含量0.1%）、β-異硫氰酸苯乙酯（β-phenylethyl isothiocyanate，β-phenylethyl ITC，含量9.4%）。其中，AITC為我國辣根含有的ITCs類物質(zhì)的主要成分，其含量高于英格蘭辣根、匈牙利辣根和日本辣根（44.3%～55.7%）[11-12]。

1.2 AITC的制備

AITC的化學結構式為CH2=CHCH2N=C=S，分子量99.16，沸點為152℃，凝固點-80℃，密度為1.012 6 g/mL。常溫下為淡黃色透明油狀液體，具有強烈的揮發(fā)性，其制備主要有以下兩種途徑。

1.2.1 從十字花科植物中提取

一些蔬菜如甘藍中AITC的濃度大概在800～1 000 mg/kg[24]，芥菜種子中含有的AITC濃度最高，約為2 500～5 000 mg/kg。從辣根等十字花科植物中提取AITC的經(jīng)典方法是水蒸氣蒸餾法和超臨界CO2流體萃取法。以辣根為例，Wu等[25]比較了水解時間、溫度、pH和添加劑抗氧化劑對于AITC前體的水解效果，最終發(fā)現(xiàn)采用20 mg/g抗氧化劑叔丁基對苯二酚65℃水解120 min（pH=4）時AITC前體物質(zhì)水解程度最佳，以二氯甲烷作為萃取溶劑最優(yōu)，采用超臨界CO2液體萃取法產(chǎn)生的AITC產(chǎn)量為6.10%，高于水蒸氣蒸餾產(chǎn)率（5.83%）。鄭建秋等[26]將粉碎后的芥菜籽加入反應釜容器中，采用50℃、pH為4.0～6.5的酸性水浸泡2 h，催化芥菜籽中的GSLs為異硫氰酸烯丙酯，采用亞臨界水萃取技術（2Mpa、120℃）對反應釜中的物質(zhì)進行萃取，然后分離反應釜中的物質(zhì)，即得到含異硫氰酸烯丙酯的辣根素粗產(chǎn)物，產(chǎn)物中AITC含量為66.5%，產(chǎn)油率為2.3%。該制備過程不僅綠色安全，且易于操作，反應歷程短，萃取率高。

1.2.2 仿生化學合成路徑

從十字花科植物中提取辣根素操作復雜，能耗過高，提取效率低，難以規(guī)模生產(chǎn)，因此AITC的化學合成備受關注[27]。目前AITC主要通過仿生合成進行制備，其中具有工業(yè)化前景的合成途徑是以烯丙基鹵與硫氰酸鹽作為原料，通過液固非均相反應及將溶劑改為乙醇后的均相反應。國外團隊如美國、俄羅斯（RUSS2321581）、日本（JP181053）、印度等均有關于AITC的合成工藝[28]。國內(nèi)王向輝等[29]選用l， 3-二溴丙烷、鄰苯二甲酰亞胺鉀、硫脲、二硫化碳及取代溴芐為原料，經(jīng)5步反應合成了8個未見報道的辣根素類化合物。劉學勇等[27]綜述了國內(nèi)外主要的合成工藝，認為李健強、曹永松團隊等采用烯丙基胺、二硫化碳和雙氧水為主要原料的制備工藝簡單，產(chǎn)品收率達90%，含量達到97%，具有較大的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)價值[30]。

2 AITC的農(nóng)用活性

已報道，AITC具有廣譜高效的殺菌、殺線蟲、殺蟲作用活性（見表2）。同時因其來源于植物且具有很高的安全性，美國環(huán)境保護署（US EPA）也許可將其登記為風險較低的生物農(nóng)藥之一[31]。

表2 已報道的AITC具有活性的部分靶標生物

Table 2 Reported target organisms of AITC

2.1 對土傳植物病原生物的活性

早期人們發(fā)現(xiàn)，芥菜籽、山葵、辣根等植物具有殺菌活性。Angus等發(fā)現(xiàn)將甘藍和芥菜等植物的碎粉深埋至土壤中，可以抑制小麥全蝕病菌Gaeumannomyces graminis var. tritici的生長，并首次將這種方法稱為“生物熏蒸”[32]。由于連作或伴隨灌溉，土壤中的腐霉Pythium與疫霉Phytophthora等不斷在田間土壤環(huán)境中累積[33]，對此Weerakoon等[34]以芥菜種子糠（seed meal）改良土壤，建立了一種以“生物介導”的能夠長期抑制病原菌積累的策略，有效地控制了蘋果園內(nèi)樹苗根腐病的發(fā)生[35]。研究揭示其中具有抑菌作用的成分是包括AITC在內(nèi)的多種ITCs類物質(zhì)。Mark等[36]研究表明，芥菜中的AITC在24～48 h內(nèi)即可完全釋放到土壤中。

作者團隊的黃小威[37]、王彥檸等[38]研究表明，在熏蒸條件下AITC對供試的禾谷鐮刀菌Fusarium graminearum、立枯絲核菌Rhizoctonia solani等10余種植物病原真菌及瓜果腐霉Pythium aphanidermatum、辣椒疫霉Phytophthora capsici等卵菌的菌絲生長具有顯著的抑制作用，其EC50分布在0.94～24.64 μg/mL之間;對其中12種病原真菌的孢子萌發(fā)亦具有顯著抑制作用，EC50分布在0.26～0.69 μg/mL之間;試驗證實，AITC能夠導致供試土傳病原真菌及卵菌菌落擴展速度減慢，氣生菌絲稀薄、孢子萌發(fā)率降低，病原細菌菌落數(shù)量減少、生長速度減緩，對常見的植物病原菌呈現(xiàn)出廣譜、高效的抑菌活性，為辣根素熏蒸防控田間主要土傳病害提供了理論支持。

由大麗輪枝菌Verticillium dahliae引起的棉花黃萎病是一種重要的土傳植物維管束病害，嚴重影響棉花產(chǎn)量[39]。作者團隊的李慧[40]前期研究表明，20%辣根素水乳劑1 500倍稀釋液不僅對棉花黃萎病菌菌絲生長具有顯著的抑制作用，同時對棉花種子出苗和幼苗生長具有安全性。劉政等[39]采用滴灌與覆膜施藥的方式，連續(xù)兩年對20%辣根素水乳劑防控棉花黃萎病的田間效果進行研究，提出了該藥劑防控棉花黃萎病的使用技術規(guī)程，且在合作試驗地區(qū)合計輻射應用面積達到1.4萬hm2。

2.2 對果蔬地上部病蟲害靶標生物的活性

王彥檸等[38]研究表明，AITC對番茄潰瘍病菌Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis、十字花科黑腐病菌Xanthomonas campestris pv. campestris等5種植物病原細菌的生長具有顯著抑制作用，EC50分布在0.81～8.61 μg/mL之間。

北京市近幾年來大力推廣使用AITC，建立了以蔬菜無病蟲育苗、產(chǎn)前消毒預防、產(chǎn)中綜合防控和產(chǎn)后殘體無害處理有機結合的“全程綠色防控”技術體系。目前，北京市蔬菜病蟲全程綠色防控示范基地數(shù)量達到20 個，覆蓋了全市10 個區(qū)（縣），有效減少了病蟲危害程度和化學農(nóng)藥用量[41]。示范試驗證實，20% 辣根素水乳劑對煙粉虱有很好的速效性，藥后3 d防效達到70.9%，且成本低廉，操作簡便[42];采用滴灌施藥方法，發(fā)現(xiàn)其對土壤真菌中的鐮刀菌殺滅效果達到100%，對腐霉、曲霉、青霉等殺滅效果顯著;設施草莓土壤經(jīng)過辣根素消毒處理整個生長期內(nèi)的植株成活率明顯提高[43]。天津市津南區(qū)植保部門通過滴灌系統(tǒng)把辣根素注入土地后覆蓋上一層密閉的厚膜，熏蒸處理3 d即可有效殺滅多種病蟲，按照操作規(guī)程定植蔬菜，一季不用再除草、除蟲，還能保證蔬菜的品質(zhì)[44]。王曉青等在生菜定植前7 d采用20%辣根素水乳劑以隨水滴灌方式對連續(xù)種植3年以上菌核病發(fā)生嚴重的生菜地進行土壤熏蒸處理，定植后7 d使用抗重茬菌劑或使用寡雄腐霉灌根處理，對生菜菌核病防治效果可達到80%左右[45]。

2.3 對作物儲藏期病蟲害靶標的生物活性

AITC因具有強烈的揮發(fā)性以及高效的抗微生物活性，且對多種食源性致病菌具有殺滅活性，研究者認為可將AITC開發(fā)成一種新型的包裝策略，如作為“抗菌香囊（anti-microbial sachets）”防控由Aspergillus flavus引起的儲藏期花生黃曲霉素的污染[46]。Tracz等采用AITC對儲藏期玉米粒密閉熏蒸處理48 h后進行通風處理，檢測了玉米粒中AITC的殘留量。結果表明，通風24 h后，玉米籽粒中可檢測到44.5%的AITC，繼續(xù)密封保存30 d后籽粒中仍有15.5%的AITC被檢測出，說明在儲藏過程中，玉米?？梢宰鳛锳ITC的吸收維持載體，通過緩釋的方式逐漸散發(fā)到空氣中，對儲藏期玉米由5種真菌產(chǎn)生的12種毒素都具有顯著的抑制效果[47]。Nazareth等研究表明，AITC可降低儲藏期面粉中由寄生曲霉Aspergillus parasiticus產(chǎn)生的黃曲霉毒素（aflatoxin）及早熟禾鐮刀菌Fusarium poae產(chǎn)生的白僵菌素（beauvericin）和恩鐮孢菌素（enniatin）的積累[48]。除此之外，也有學者采用AITC對萵苣、蘋果、番茄、草莓、黑莓、懸鉤子等蔬果儲藏期病害進行防控研究[49-51]。在殺蟲方面，AITC也具有安全高效性且與磷化氫等無交互抗藥性[52]，可作為一種針對儲藏期害蟲防控的有效策略。

2.4 對雜草的生物活性

Ren等[53]采用AITC進行番茄地土壤熏蒸處理，發(fā)現(xiàn)其不但可以有效殺滅土壤環(huán)境中的病原真菌、細菌及線蟲等，同時對土壤中的雜草（LC50=17.3～47.7 mg/kg）也具有很好的殺滅活性。Matteo等也發(fā)現(xiàn)，十字花科作物粗提取物對大穗看麥娘Alopecurus myosuroides具有優(yōu)異的生物活性[54]。Bangarwa等研究發(fā)現(xiàn)[55]，AITC作為除草劑控制莧科植物、馬唐的效果與甲基溴相當。2018年申請的美國專利（US201801225077A1）中也表明，ITCs類特別適用于對雜草的抑制。

3 AITC殘留和安全性

3.1 AITC殘留分析方法

Tracz等[47]研究AITC防控儲藏期由Aspergillus parasiticus，F(xiàn)usarium tricinctum，F(xiàn).verticillioides以及Alternaria alternata引起的玉米毒素產(chǎn)生水平時，優(yōu)化了AITC在玉米粒中的殘留分析條件，包括1）樣品制備：將一定質(zhì)量的玉米粒浸泡在甲醇中，40℃水浴中振蕩30 min后再超聲處理10 min，20℃ 4 000 r/min離心5 min后收集上清液，過0.22 μm濾膜;2）檢測方法及條件：采用HPLC的方法，檢測器為安捷倫二極管陣列檢測器（LC-DAD），檢測波長為236 nm，分離柱為Gemini C18（4.6 mm×150 mm，孔徑3 μm），流動相為水∶乙腈（V∶V=60∶40），流速為0.8 mL/min。

吳華等[56]建立了20%AITC在幾種倉庫貯藏品中的毛細管氣相色譜殘留分析方法。該方法以二氯甲烷為提取溶劑，采用毛細管氣相色譜-火焰離子化檢測儀進行測定（與國標GB29980-2013中規(guī)定的檢測器一致），發(fā)現(xiàn)辣根素在貯藏品中的消解動態(tài)符合一級動力學方程，其半衰期為28～75 d，其降解過程主要是酶解、水解、光解。Ugolini等[57]采用固相微萃取技術，以氣相色譜火焰離子化檢測器進行測定AITC在草莓果實中的殘留。

3.2 AITC安全性評價

3.2.1 對人體的安全性

1999年AITC免除了注冊化學品的注冊授權和限制，并且在日本作為一種商品化的天然抗菌劑或防腐劑添加到食品中[58];2006年美國規(guī)定AITC可作為一種“公認安全食品”添加到食品儲藏罐中，用來延長食品保質(zhì)期和抗腐敗;2011年美國食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定AITC可作為一種食品添加劑直接加入食品中使用，而且被認為有利于人體健康[1，46];歐洲國家也明確了AITC作為食品防腐劑和食品添加劑具有安全性[59]。

Otoni等采用AITC防控由Aspergillus flavus引起的儲藏期花生黃曲霉素的污染，在前15 d約92.4%的AITC已經(jīng)降解，30 d后無AITC可檢出[46]。Ugolini采用0.1 mg/L AITC處理草莓果實4 h后，可使灰霉病發(fā)生降低47.4%～91.5%，且對果實的營養(yǎng)品質(zhì)等無影響，儲藏7 d后AITC殘留量低于1 mg/kg[57]。Santos等采用300 μL/kg的AITC對儲藏期密封保存的玉米粒真菌毒素的產(chǎn)生進行防控，結果表明，儲藏150 d后，AITC對玉米種子的發(fā)芽勢、含水量、容重以及電導率等生理指標均無影響[60]。Wu等[25]采用AITC處理稻米，其殘留量低于5 μg/g。歐盟委員會規(guī)定，AITC日攝取量（tolerable daily intake， TDI）最高為每千克體重0.06 mg[61]。研究表明，一定時間后AITC殘留基本檢測不到或含量極低，表明采用AITC進行食品保鮮或病害防控，不太可能導致儲藏產(chǎn)品中的殘留問題，也不太可能會對人類健康產(chǎn)生威脅。美國國家環(huán)境保護局（United States Environmental Protection Agency）官方數(shù)據(jù)表明，AITC安全性高，對嬰幼兒等也無不良反應（https：∥www.epa.gov/）。

3.2.2 對非靶標生物的安全性

Zaborski等采用100 mg/L的AITC作驅避劑收集土壤中的蚯蚓，其收集效果與200 mg/L的福爾馬林相比無顯著差異，且對蚯蚓具有更小的毒性，因此認為將AITC引入土壤環(huán)境中是安全的[62]。Borek等[63]測定了AITC在6種不同土壤中的半衰期，為20～60 h，且隨著土壤水分的降低和溫度的升高，AITC降解速度加快。Isagro美國公司聯(lián)合美國多所大學的研究人員針對以AITC為原料登記的土壤熏蒸劑“DOMINUS”進行了嚴格的測試，說明其在土壤中能快速降解，在作物種植前施用，土壤中不會殘留，是一款環(huán)境友好型的產(chǎn)品[64]。Wu等認為AITC對非靶標生物具有極低的毒性，因此也易被農(nóng)戶接受[65]。

研究報道[36，66]表明，土壤中的有益微生物如Trichoderma spp.等對AITC不敏感，展現(xiàn)出很強的忍耐性。Weerakoon等也發(fā)現(xiàn)AITC處理過的土壤環(huán)境中，T.hamatum和T.virens仍然是主要群體[34]。美國EPA官方數(shù)據(jù)表明AITC對環(huán)境友好，對非靶標生物（除部分昆蟲如蜜蜂外）無毒性作用[67]。

4 AITC的農(nóng)藥登記與產(chǎn)業(yè)化應用

4.1 AITC劑型研發(fā)

由于AITC分子量很小，化學性質(zhì)活潑，常溫下具有很強的揮發(fā)性和刺激性，給使用帶來了不便。彭家華采用分子包結絡合法，制備了AITC微膠囊劑。該微膠囊劑有一定的緩釋作用且利用率可提高到80%左右[68]。中國農(nóng)業(yè)大學李健強團隊選用高吸附性惰性材料等載體和助劑制備了多種用途的AITC劑型：包括水乳劑，顆粒劑，緩釋型顆粒劑，緩釋型紙片、塑料、塊、袋等。

4.2 AITC施藥器械及方式

辣根素是新型植物源藥劑，作為土壤處理劑可有效殺滅多種土壤微生物，防控多種土傳病害。施藥時可根據(jù)土傳病害發(fā)生嚴重程度選擇隨水滴灌施用或在播種前或移栽前采用起壟覆膜密封后，進行土壤熏蒸。

常用施藥器械有煙霧施藥機、遠程機動噴霧器等高效施藥器。目前，由北京市果類蔬菜創(chuàng)新團隊病蟲防控研究室聯(lián)合設施設備研究室研發(fā)的辣根素土壤消毒專用施藥機械已面世，該設備基本具備液態(tài)藥劑土壤注射施用功能，機具采用履帶式行走，穩(wěn)定性高;可根據(jù)行走速度精準設定施藥量;可根據(jù)消毒需要調(diào)節(jié)施藥深度;采用多重防堵防漏措施，具有很高的施藥安全性（http：∥www.bjny.gov.cn/）。當然，由于AITC具有強烈的刺激性，進行消毒時，操作人員應該進行自身防護，如佩戴護目鏡、防毒面具等。

4.3 AITC的農(nóng)藥登記

以AITC為原料進行的農(nóng)藥登記，最早是美國約旦農(nóng)業(yè)公司2000年登記的“Dazitol”。它是一種由辣椒素及相關物質(zhì)（有效含量為0.42%）和異硫氰酸烯丙酯（有效含量為3.7%）組成的混合物，用于土壤處理可有效殺滅或抑制土壤中的線蟲、有害昆蟲、病原菌及雜草[69]。目前Dazitol正式登記的國家或地區(qū)有智利、約旦、阿聯(lián)酋、科威特、美國、希臘、土耳其、摩洛哥、黎巴嫩、以色列、墨西哥、哥倫比亞、巴西、阿根廷、泰國、秘魯、埃及、西班牙、伊拉克等（http：∥www.ynlagensu.com/userlist/lclmsw/text-9449.html）。除此之外，Isagro美國公司2014年登記的以AITC為活性成分的“Dominus”產(chǎn)品（https：∥www.isagro.com/prodotti/fumiganti.html）是第一款可同時用于傳統(tǒng)及有機耕種的土壤生物熏蒸劑，對土壤中的真菌、線蟲、雜草和昆蟲具有廣譜防治功效，其登記類別為“以天然物質(zhì)為基礎的生物農(nóng)藥”[65]。2017年，Mardel Rose Belotinsky TriCal公司登記了AITC與氯化苦的復配制劑投入市場（http：∥www.trical.com/）。

2018年，以AITC為有效成分的我國自創(chuàng)品牌“70%辣根素原藥”（登記證號：PD20181601）和“20%辣根素水乳劑”（登記證號：PD20181600）由云南聯(lián)創(chuàng)利民生物工程有限公司獲得首家農(nóng)藥登記，用于防治番茄根結線蟲。

4.4 AITC替代溴甲烷的應用

溴甲烷作為一種熏蒸類殺蟲劑由來已久[70]。1932年法國首先使用，1937年后廣泛使用于植物檢疫熏蒸處理，我國于1953年開始用于熏蒸棉籽，后逐漸用于陸地或船艙中的熏蒸滅蟲及倉儲期殺蟲[71]。根據(jù)《蒙特利爾議定書》哥本哈根修正案，發(fā)達國家和發(fā)展中國家分別于2005年和2015年淘汰使用溴甲烷。為了淘汰溴甲烷，各國科學家都在努力尋找安全、經(jīng)濟、有效的替代品，并取得了一些進展，如磷化氫、威百畝、氯化苦等[56]。但隨著用藥歷史的延長，多個國家出現(xiàn)了包括玉米象、谷蠹、赤擬谷盜、嗜蟲書虱等在內(nèi)的至少11種儲藏物害蟲表現(xiàn)出對磷化氫，溴甲烷等的抗性[72-75]，因此，尋找新型的安全、高效、可替代溴甲烷和磷化氫的新型化學品迫在眉睫。

曹坳程等[69，78]早在2006年提出AITC是一種安全、環(huán)境相容性好的熏蒸劑，是溴甲烷的潛在替代品。近年來，國內(nèi)越來越多的團隊通過大量的田間實踐，證明AITC具有廣闊的應用前景。

為實現(xiàn)中國政府的履約目標，由環(huán)境保護部和農(nóng)業(yè)部共同組織實施了農(nóng)業(yè)行業(yè)甲基溴淘汰項目，舉辦了“2015年農(nóng)業(yè)行業(yè)甲基溴淘汰與土壤消毒技術培訓班”，由北京市植保站作為執(zhí)行和技術指導單位，聯(lián)合中國農(nóng)業(yè)科學院、中國農(nóng)業(yè)大學、山東省農(nóng)業(yè)環(huán)境保護和農(nóng)村能源總站以及多個企業(yè)在山東、河北等省市開展辣根素土壤消毒試驗，為溴甲烷替代藥劑的開發(fā)和應用提供試驗數(shù)據(jù)，推動溴甲烷淘汰項目順利實施[76]。

國內(nèi)以云南聯(lián)創(chuàng)利民生物工程有限公司為代表的企業(yè)，大力開展以AITC為有效成分的農(nóng)藥制劑開發(fā)，在馬鈴薯病害綜合防治、棉花黃萎病、草莓根腐病、蔬菜根結線蟲等主要作物種傳、土傳病蟲害，以及大宗蔬菜黃瓜、番茄等蔬菜多種地上部病蟲害治理中取得了良好的防控效果。目前，國內(nèi)中國農(nóng)業(yè)大學以及云南農(nóng)業(yè)大學等高校也積極采用AITC防控魔芋細菌性軟腐病、具有連作障礙的三七根腐病以及食用百合根及鱗莖腐爛病[77]等，取得了階段性進展。

5 AITC的作用機制

吳華等對AITC在醫(yī)學領域抗腫瘤、抗癌的活性，以及其對倉儲害蟲、病原微生物、線蟲、雜草等農(nóng)業(yè)有害生物的活性研究進行了綜述[79]。本文結合文獻報道重點對AITC的作用機制進行評述。

5.1 誘導線蟲細胞壓力

Saini等用AITC處理秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans，采用RT-qPCR方法研究了AITC對其熱激蛋白基因HSP70表達的影響。結果發(fā)現(xiàn)，低濃度AITC（<0.1 μmol/L）處理對HSP70的表達無影響，而高濃度（>0.1 μmol/L）處理，HSP70的表達會增加4～5倍，表明AITC可以誘導線蟲細胞壓力，進而起到毒力效果[80]。

5.2 對昆蟲的毒力機制

Wu等采用AITC熏蒸處理玉米象，透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，線粒體基質(zhì)變得稀疏且空泡化現(xiàn)象嚴重。進一步作者又研究了AITC對玉米象中谷胱甘肽S-轉移酶、過氧化氫酶、細胞色素C氧化酶和乙酰膽堿酯酶的活性，結果表明，4種酶的活性均與AITC的處理時間和劑量有關，即低劑量呈現(xiàn)活性增強，高劑量呈現(xiàn)活性抑制。作者推測，線粒體可能是AITC的作用位點之一且細胞色素C氧化酶可能是AITC的作用靶標蛋白[81];進一步研究表明，AITC對線粒體復合物IV的抑制效果比復合物I更為明顯，預示了線粒體復合物IV可能是AITC的初級靶標[82]。同時，通過克隆玉米象中細胞色素C氧化酶亞基Ⅱ，并純化該蛋白，進一步分析了AITC對該酶的活性，采用同源建模（homology modeling）以及分子對接（molecular docking）分析認為，AITC中的硫原子可以與細胞色素C氧化酶亞基Ⅱ上的一個亮氨酸殘基結合[83]。進一步結合RNA-seq數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)AITC熏蒸處理玉米象后，玉米象117個基因出現(xiàn)過表達，271個基因下調(diào)表達。KEGG富集分析表明，大多數(shù)基因富集集中在“折疊、分類和降解”、“運輸和分解代謝”、“能量代謝”和“碳水化合物代謝”。提出了細胞骨架丟失和線粒體功能障礙是AITC對玉米象的致死機制[84]。

5.3 抑制植物病原菌的相關機制

已報道AITC具有抗癌活性，胞內(nèi)靶標涉及多種，如細胞色素P-450（CYP450）、抗氧化過程、腫瘤發(fā)生、細胞凋亡、細胞周期與轉移等過程相關的蛋白[85]。

Bailey等報道了甘藍中ITCs類物質(zhì)自然水解產(chǎn)物，包括硫化氫、二硫化碳以及其他胺化成分，發(fā)現(xiàn)部分水解產(chǎn)物同樣具有抑菌活性[86];Tang等也描述了微生物對ITCs類物質(zhì)的降解，認為芐胺（benzylamine）為主要產(chǎn)物[87]。Kawakishi等認為，ITCs可通過破壞蛋白之間的二硫鍵，影響細菌細胞的蛋白質(zhì)結構[88];Kojima等對多種ITC物質(zhì)進行了測試，發(fā)現(xiàn)其均可顯著性抑制酵母的細胞色素C氧化酶的活性，影響酵母細胞的代謝功能[89]，但與典型的呼吸抑制劑如KCN與抗霉素A相比，AITC對待測酵母的MIC濃度卻低了100倍左右，說明AITC并不是一種強烈的呼吸抑制劑，也說明抑制氧攝取并不是AITC的主要抑菌機制[90];Lim等發(fā)現(xiàn)，ITCs類物質(zhì)也可影響β-半乳糖苷酶活性，誘導細胞代謝物泄露，抑制革蘭氏陰性細菌生長[91]。Delaquis等則認為，ITCs類物質(zhì)可能是發(fā)揮了氧化磷酸化解偶聯(lián)劑的作用，因為對于嚴格好氧的真菌而言，其對ITCs類物質(zhì)具有更高的敏感性[5]。ITCs完整的作用機制至今仍然不清楚[92]，以往的文獻中也并沒有揭示單一的作用位點，因此，其作用機制通常被認為是作為一種非特異性的抑制劑。

Isshiki等研究了AITC對多種細菌的抑制效果。結果表明，相比革蘭氏陽性菌，陰性細菌對AITC的敏感性更高[93]。Lin等發(fā)現(xiàn)，處于指數(shù)期細菌比處于穩(wěn)定期細菌對AITC敏感性更高;同時，通過比較青霉素、鏈霉素、多黏菌素B以及AITC，認為AITC的作用機制與多黏菌素B更為接近，因為多黏菌素B具有一個親水性七肽環(huán)和一個疏水鏈，使其具有兩性分子的屬性，而AITC同樣具有兩性分子屬性，即含有一個極性的末端和一個非極性末端鏈，這使得AITC可以更容易改變胞膜通透性[10， 90， 94]。

AITC對害蟲的作用機制尚未完全建立[25]，也有很多假說提出，一些人認為AITC可以與含硫基團、二硫鍵、蛋白質(zhì)的氨基酸、氨基酸殘基發(fā)生非特異性以及不可逆的結合。Murata等[95]認為AITC還可誘導DNA損傷。

王彥檸[96]通過掃描電鏡觀測菌絲表面形態(tài)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)AITC熏蒸處理的供試菌菌絲出現(xiàn)不同程度的皺縮、畸形、瘤狀突起及內(nèi)容物外滲等現(xiàn)象，透射電鏡可觀測到菌絲外壁及膜結構破裂受損，細胞壁不規(guī)則增厚或消解，甚至出現(xiàn)細胞壁剝落;進一步研究發(fā)現(xiàn)，AITC可增加細胞膜通透性，對供試真菌具有低濃度促進呼吸高濃度抑制呼吸的雙重作用，且隨著藥劑處理濃度的增加，供試靶標菌菌絲中ATP含量及能荷值均降低。

5.4 AITC誘導植物抗性機制

研究表明，AITC對于植物生長和存活是一種重要的防衛(wèi)成分[97]。Sporsheim等研究發(fā)現(xiàn)[98]，AITC通過可逆地抑制高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、過氧化物酶體和液泡中依賴肌動蛋白的細胞內(nèi)轉運。Khokon等研究報道，AITC可以誘導蠶豆、擬南芥氣孔關閉，從而保護自身避免水分喪失或潛在病原菌的侵染[99-100]。Wang等[101]研究表明，AITC可以增強藍莓果實H2O2的產(chǎn)生和自由基形成，從而對病原菌產(chǎn)生高強度的氧化壓力，提高藍莓對病原菌的抵抗作用。除此之外，ITCs類物質(zhì)作為化感物質(zhì)、硫儲存物質(zhì)，以及在耐熱、細胞凋亡、生長抑制、信號轉導等方面也發(fā)揮重要作用。Calmes等以Alternaria brassicicola作為模式菌株，研究了其與十字花科蔬菜大白菜的互作過程。結果表明，植物體內(nèi)的GSLs降解產(chǎn)物（即ITCs類物質(zhì)）可誘導A.brassicicola胞內(nèi)氧消耗降低、活性氧ROS積累下降，線粒體膜電位下降。同時發(fā)現(xiàn)，A.brassicicola中一個涉及MAP激酶基因（AbHog1）和一個轉錄因子（AbAP1）參與了植物與病原菌的互作過程[102-103]。

6 展望

隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)集約化程度不斷提高，特別是設施農(nóng)業(yè)快速發(fā)展，導致土傳病蟲害的問題日益突出;同時，農(nóng)藥化肥等的不合理使用也對空氣、土壤和水體等造成了嚴重的面源污染。甲基溴是國際上公認的土壤熏蒸效果最好的藥劑[77]，但由于其具有破壞臭氧層作用，聯(lián)合國已將其禁用。2016年由科技部首次啟動“化學肥料和農(nóng)藥減施增效綜合技術研發(fā)”項目，提出“優(yōu)先選用生物農(nóng)藥或高效低毒低殘留化學農(nóng)藥”。AITC作為一種廣譜、高效、安全的生物熏蒸劑，各國學者對其生物活性的研究已較為寬廣，這充分表明辣根素是極具應用潛力的一類化合物。

6.1 拓展AITC研究，為作物綠色防控提供新舉措

AITC是一類國內(nèi)外高度關注和重視研究開發(fā)的藥劑，可以滿足和適應于保護地或覆膜栽培、倉儲期病蟲害的防控等方面。推動植物病蟲害的源頭控制，播種或移栽前通過土壤熏蒸處理，可從源頭降低田間初始病蟲數(shù)量，有效降低病蟲害的發(fā)生危害;生長期內(nèi)對棚室進行熏蒸消毒，還可以有效降低蔬菜霜霉病、白粉病等多種氣傳病害和煙粉虱、薊馬等小型害蟲的為害。一藥多靶標，實現(xiàn)對作物生長不同階段病蟲害的預防和治理。同時，因其為植物源農(nóng)藥，具有環(huán)境友好特征，可使其對環(huán)境造成污染的程度降至最低。

6.2 推動AITC產(chǎn)業(yè)化，為國家甲基溴替代提供新路徑

國家甲基溴替代過程并非一蹴而就。自2003年批準《蒙特利爾議定書》哥本哈根修正案以來，中國就一直致力于甲基溴的替代工作。2008年起，農(nóng)業(yè)部、環(huán)境保護部和聯(lián)合國工業(yè)發(fā)展組織共同啟動了農(nóng)業(yè)甲基溴淘汰項目，農(nóng)業(yè)部科技教育司作為具體實施單位，專設農(nóng)業(yè)行業(yè)甲基溴淘汰項目辦公室，協(xié)調(diào)各地方政府、科研單位、企事業(yè)單位、農(nóng)戶等開啟了長達10年的履約征程，最終篩選出了對靶標菌滅菌活性高、對食品安全及對非靶標微生物干擾小的替代熏蒸劑，辣根素便名列其中。基于無殘留的綠色土壤配套處理措施，很好地解決了多種作物土傳病蟲害的危害，農(nóng)業(yè)部于2011年宣布撤銷甲基溴在草莓、番茄、黃瓜等作物上的登記。隨著生姜產(chǎn)業(yè)的異軍突起，土傳病害造成的問題凸顯。氯化苦作為唯一登記的替代品，無法有效控制根結線蟲。為避免對行業(yè)的沖擊，2014年中國又向聯(lián)合國臭氧保護秘書處提出申請，為部分生姜產(chǎn)區(qū)甲基溴防控根結線蟲爭取到一定的豁免權。國家項目辦綜合考慮履約形式及國家對高毒農(nóng)藥逐步淘汰戰(zhàn)略，最終承諾2019年1月1日起全面禁止甲基溴在農(nóng)業(yè)上的使用。2018年我國已經(jīng)實現(xiàn)AITC為有效成分的自創(chuàng)品牌“70%辣根素原藥”（登記證號：PD20181601）和“20%辣根素水乳劑”（登記證號：PD20181600）首家登記，有望為我國甲基溴替代提供新的路徑。

6.3 強化AITC應用培訓，打通技術推廣“最后一公里”

辣根素作為一種新型土壤消毒劑，因其強烈的揮發(fā)刺激性，加之農(nóng)戶對土壤消毒的認知水平整體偏低，導致其在推廣應用中面臨一定的挑戰(zhàn)。因此，應不斷加強對其劑型、施藥器械等的研究開發(fā)以及對田間應用效果、安全性等的評價研究，同時做好宣傳普及推廣;倡議創(chuàng)設全國辣根素應用技術合作聯(lián)盟，加大投入力度，增強與地方農(nóng)技服務中心、植保站等的合作，形成系統(tǒng)，通過開設辣根素應用技術培訓班，不斷強化管理人員、生產(chǎn)企業(yè)、經(jīng)銷商及農(nóng)戶等的認知水平。通過試驗示范和田間現(xiàn)場反饋，不斷完善和制定辣根素的使用技術規(guī)程;不斷加強農(nóng)戶對土壤熏蒸的認知，嚴格按照使用技術規(guī)程操作，確保農(nóng)事操作人員和作物生產(chǎn)安全。

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（責任編輯： 楊明麗）