飲酒與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤關(guān)聯(lián)的孟德爾隨機(jī)化研究

劉新志　吳新龍　許敏華等

[摘要]目的 探討飲酒與顱內(nèi)動(dòng)脈瘤（inlracranial aneurvsm，TA）發(fā)病的關(guān)系。方法 選取本院接診的421例未破裂IA（unruptured intracranial aneurvsm，UIA）患者為觀察組和425例非IA患者作為對照組。收集研究對象的一般人口學(xué)情況、病史、行為因素和體格檢查，并采集外周血3ml進(jìn)行遺傳易感性檢測。采用孟德爾隨機(jī)化方法（mendelian random-ization，MR），以乙醇脫氫酶-1B基因（alcohol dehydrogenase-1B，ADHIB）的功能性突變點(diǎn)rs1229984作為工具變量，分析飲酒與UIA的關(guān)系。結(jié)果 ADH1B（rsl229984）的基因型在不同的年齡、性別、體型、糖尿病史、高血壓史、吸煙的人群中的分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；基因型變異與UIA的發(fā)生比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意議（P>0.05）；是否飲酒、不同飲酒量人群中基因型的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。因而rs1229984符合作為工具變量的條件。應(yīng)用Logistic回歸模型分析，結(jié)果顯示是否飲酒、適量飲酒及過度飲酒與UIA無相關(guān)關(guān)系（OR=0.95～1.18，P>0.05）；MR法分析結(jié)果顯示與不飲酒相比，飲酒、適度飲酒、過度飲酒與TA也無相關(guān)關(guān)系（OR=0.26～4.01，P>0.05）。結(jié)論 飲酒與TA的發(fā)生之間不存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)。

[關(guān)鍵詞]腦動(dòng)脈瘤；飲酒；乙醇脫氫酶-1B基因；孟德爾隨機(jī)化

中圖分類號：R651.12 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-816X（2018）03-0177-134

doi：10.3969/j.issn.1009-816x.2018.03.002

顱內(nèi)動(dòng)脈瘤（Intmcranial aneurysm，TA）為腦動(dòng)脈血管的球囊性擴(kuò)張膨脹，其發(fā)生破裂后可造成50%患者死亡，同時(shí)30%的幸存者留有嚴(yán)重的后遺癥。迄今為止，尚無有效的TA破裂預(yù)防手段，對TA的治療也以有創(chuàng)的手術(shù)夾閉和栓塞為主，且手術(shù)過程伴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。因此，了解TA的病因和發(fā)病機(jī)制是解決TA問題的關(guān)鍵。TA的病因復(fù)雜，目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。吸煙、男性、高血壓等多種因素均能增加TA的形成。然而，飲酒與TA發(fā)病的關(guān)系尚未明確。此外，傳統(tǒng)的觀察性病因研究時(shí)，由于混雜偏倚的困擾無法排除，同時(shí)暴露和結(jié)局的時(shí)間順序也常被混淆，常常造成研究結(jié)果的不一致性并受到質(zhì)疑。為解決上述問題，Katan提出了孟德爾隨機(jī)化（Mendelian Randomization，MR）設(shè)計(jì)。MR將基因作為待研究暴露因素的工具變量（instrumental variable），用基因型和疾病的關(guān)聯(lián)效應(yīng)模擬暴露因素對疾病的作用，由于等位基因在配子形成時(shí)遵循隨機(jī)分配的孟德爾遺傳規(guī)律，因此基因與疾病的關(guān)聯(lián)不會(huì)被傳統(tǒng)流行病學(xué)研究中的混雜和反向因果關(guān)系所歪曲，進(jìn)行因果推斷時(shí)具有獨(dú)特的優(yōu)勢。因此，本研究采用MR設(shè)計(jì)分析飲酒與TA的關(guān)系，為進(jìn)一步闡明TA的發(fā)病機(jī)制提供線索。

1資料與方法

1.1一般資料：選擇2015年1月至2016年12月期間，在湘雅醫(yī)院神經(jīng)外科和神經(jīng)內(nèi)科招募就診的421例TA未破裂（unnlDtured intracranial aneurvsm，UIA）患者為觀察組（共450個(gè)顱腦動(dòng)脈瘤）和425名非TA患者作為對照組。TA患者納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)CTA或DSA確診TA的患者；（2）TA尚未破裂；（3）漢族；（4）同意參與本研究。TA患者排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）腦動(dòng)靜脈畸形伴IA；（2）梭形或夾層腦動(dòng)脈瘤；（3）單純閉塞載瘤動(dòng)脈的動(dòng)脈瘤；（4）曾經(jīng)出現(xiàn)過因TA破裂或不明原因?qū)е碌娘B內(nèi)出血；（5）存在溝通困難無法完成問卷者。對照組的納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)CTA或DSA確診的非TA患者；（2）顱腦無其他器質(zhì)性病變；（3）患者同意參與本研究；（4）漢族。對照組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）出現(xiàn)過不明原因的顱內(nèi)出血；（2）存在嚴(yán)重慢性病或不能配合完成問卷者。

1.2方法：所有研究對象需接受現(xiàn)場問卷調(diào)查和體格檢查。問卷調(diào)查采用自行設(shè)計(jì)的問卷，內(nèi)容包括社會(huì)人口學(xué)情況，如年齡和性別；行為危險(xiǎn)因素如吸煙和飲酒；疾病現(xiàn)患和家族史，如高血壓和糖尿病現(xiàn)患史和服藥情況，TA家族史等。體格檢查主要包括身高、體重和血壓。

采集研究對象外周血3ml至EDTA抗凝管中，-20℃保存，于48h內(nèi)使用Qiagen試劑盒提取DNA并進(jìn)行rs1229984多態(tài)性檢測，并進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)。該位點(diǎn)是位于染色體4q22的乙醇脫氫酶-1B基因（Alcohol Dehvdrogenase-1B，ADH1B）的突變位點(diǎn)，A等位基因的變異能夠影響機(jī)體的乙醇氧化能力和飲酒行為，因此本研究使用ADH1B（rs1229984）作為飲酒暴露的工具變量，分析飲酒與TA發(fā)生的關(guān)系。SNP分型采用多聚酶鏈反應(yīng).限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RELP）法測定：引物為5-agaaaea-caattteaggaatttgg-gt-3和5-actoaccacgtggtcatctgcg-3；在PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性2min，經(jīng)30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)95℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，最后72℃保溫7min；PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化，并通過3%瓊脂糖凝膠分離后行DNA測序分析。

飲酒指每周飲酒2次及以上或達(dá)到50ml，并持續(xù)1年以上者?！斑m量飲酒”是指每天飲酒男性不超過24克純酒精（相當(dāng)于每周168克），女性不超過12克純酒精（相當(dāng)于每周84克）。根據(jù)公式換算被訪對象的每周飲用酒精量（飲用酒精量：飲酒量（毫升）×酒度數(shù)×0.8（酒精密度）），將飲酒者劃分為適量飲酒與過度飲酒（男性≥168克/周；女性≥84克/周）。吸煙指連續(xù)吸煙6個(gè)月及以上，每日至少一支。體質(zhì)量指數(shù)（BMI）=體重（kg）/身高（m）²，BMI<18.5kg/m²為低體重，BMI：18.5～23.9kg/m²為正常體重，BMI：24.0～27.9kg/m²為超重，BMI：≥28kg/m²為肥胖。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所有統(tǒng)計(jì)均采用Stata 12.0版軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料使用（x±s）表示，組間比較采用方差檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料使用頻數(shù)和率表示，組間比較用卡方檢驗(yàn)，趨勢分析采用趨勢性卡方檢驗(yàn)；采用多因素Logistic回歸分析飲酒與TA的關(guān)系；用孟德爾隨機(jī)化法，以rs1229984作為工具變量，建立回歸模型，得到的結(jié)果采用bootstrap法與多因素Logistic回歸分析結(jié)果進(jìn)行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1一般情況比較：兩組在年齡、性別、體型、糖尿病史和是否飲酒的分布上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。觀察組較對照組高血壓、吸煙和過量飲酒者更多（P<0.05）。ADH1B基因（rs1229984）不同基因型在兩組的分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表1。

2.2 ADH1B基因（rs1229984）與飲酒及其他混雜因素的關(guān)系：ADH1B基因（rs1229984）的基因型分布情況在不同的年齡、性別、體型、糖尿病史、高血壓史、吸煙的人群中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。ADH1B基因rs1229984基因型在是否飲酒、不同飲酒量人群中的分布不完全相同，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與不飲酒者相比，飲酒者、過量飲酒者rsl229984更可能為GG基因型，見表2。

2.3孟德爾隨機(jī)化分析飲酒與TA的關(guān)系：在使用Logistic回歸控制混雜因素后，與不飲酒相比較，飲酒與否、適量飲酒及過度飲酒與TA的發(fā)生均無相關(guān)關(guān)系OR分別為1.00（95% CI：0.68，1.05），0.95（95%CI：0.79，1.00）和1.18（95% CI：1.00，2.01）。將rs1229984基因型作為飲酒行為的工具變量，結(jié)果顯示與不飲酒相比，飲酒、適度飲酒、過度飲酒與TA亦不存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)OR分別為1.45（95%CI：0.18，10.98），0.41（95%CI：0.26，1.01）和4.01（95%CI：0.99，11.07）。采用bootstrap重復(fù)估計(jì)的方法，比較Logistic回歸模型與工具變量模型，兩種方法獲得的關(guān)聯(lián)OR值在估算飲酒與否、適度飲酒、過量飲酒與TA的關(guān)聯(lián)中的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見表3。

3討論

ADH1B是人體乙醇代謝中最主要的同工酶，其基因的多態(tài)性可直接影響飲酒行為，當(dāng)rs1229984攜帶GG基因型時(shí)，個(gè)體ADH1B的表達(dá)量相對于野生型表達(dá)量減少約40倍。因此，乙醇進(jìn)入體內(nèi)后代謝為乙醛的速度降低，飲酒后更容易耐受，常常飲用更多的酒。本研究亦觀察到rs1229984基因型與飲酒行為相關(guān)。不同的性別、年齡、高血壓史、糖尿病史、BMI和吸煙者中基因型分布的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此rs1229984基因型與研究中已知的混雜無關(guān)。此外，本研究也顯示，rs1229984基因型與TA的發(fā)生并不存在直接的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)?；谝陨锨闆r，rs1229984基本滿足工具變量的要求，為了更好的控制混雜，本文選取該基因作為工具變量，采用MR法探討飲酒與TA的關(guān)聯(lián)。了解TA的病因和發(fā)病機(jī)制是解決TA問題的關(guān)鍵。研究表明，飲酒可以引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性及變性反應(yīng)。在嚴(yán)重酗酒者中，長期大量的乙醇暴露后還可觀察到細(xì)胞內(nèi)ROS形成，血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞受損、血管滲透性增加。因此飲酒與TA形成及預(yù)后的研究倍受關(guān)注。然而飲酒與TA的形成之間的關(guān)聯(lián)存在一定爭議：Kang通過比較367例UIA與18587例對照發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)不同位置的TA，造成其形成的危險(xiǎn)因素不完全相同，雖然總的TA形成與飲酒無關(guān)聯(lián)，但是前交通動(dòng)脈TA的形成與飲酒存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)（調(diào)整OR=2.54，P=0.01）。Juvela卻發(fā)現(xiàn)飲酒或酗酒都與多發(fā)性TA的形成無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。本研究也未觀察到TA與飲酒行為及飲酒量之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)，乙醇的攝入可能不會(huì)影響TA的形成，既往研究中觀察到的飲酒者TA變大或破裂風(fēng)險(xiǎn)增加，可能是飲酒后一過性的血壓增加并伴隨血流動(dòng)力的改變所致。本研究由于缺乏TA位置的數(shù)據(jù)，對于具體血管TA的形成與飲酒的關(guān)聯(lián)還需要進(jìn)一步研究。

與既往的研究相比，本文在討論飲酒與TA的關(guān)聯(lián)時(shí)，不僅考慮了飲酒與否還考慮了飲酒量與TA的關(guān)聯(lián)。收集了患者的BMI、疾病史等數(shù)據(jù)，控制了已知的混雜因素。此外，最重要的是，本研究采用了孟德爾隨機(jī)化設(shè)計(jì)，該設(shè)計(jì)在研究暴露與疾病的關(guān)聯(lián)時(shí)，可避免研究結(jié)果被混雜和反向因果關(guān)系所歪曲，具有因果推斷的獨(dú)特優(yōu)勢。但本研究也存在缺點(diǎn)，如，沒有討論不同位置的TA與飲酒的關(guān)聯(lián)；只選取了一個(gè)影響乙醇代謝的相關(guān)的ADH1B基因，而影響乙醇代謝通路的基因及多態(tài)性位點(diǎn)較多，可能存在基因多效性和交互作用。因此，在今后的研究中可選擇多個(gè)基因聯(lián)合作為工具變量將有助于進(jìn)一步驗(yàn)證飲酒與TA的關(guān)聯(lián)。

綜上所述，本研究以ADH1B基因作為變量工具，采用孟德爾隨機(jī)化法分析了飲酒行為與TA發(fā)生之間的關(guān)聯(lián)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)飲酒與TA的發(fā)生之間不存在具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)聯(lián)。