豬偽狂犬病病毒PCR-LFD檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

張 莉，任衛(wèi)科，李秀麗，路 超，王利麗，鄭 麗，池晶晶，田向?qū)W，韓 偉，鄢明華

(1.農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)天津科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，天津 300381；2.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津 300381)

豬偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由皰疹病毒科、α-皰疹病毒亞科的偽狂犬病病毒(Pseudorabies viurse，PRV)引起的多種動(dòng)物的一種高度接觸性傳染病[1]。豬是自然宿主。該病可導(dǎo)致懷孕母豬的流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎和種豬不育等癥狀；哺乳仔豬常出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和死亡；成年豬一般呈亞臨床或隱性感染，成為病毒的貯存宿主，長(zhǎng)期排毒，但是自2011年后，我國(guó)多地區(qū)豬場(chǎng)中出現(xiàn)偽狂犬病病毒變異毒株，一些成年豬也出現(xiàn)神經(jīng)癥狀和高病死率等情況[2-3]。豬偽狂犬病流行狀況的變化給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大損失，因此，特異、敏感、快速的診斷方法對(duì)該病的防控至關(guān)重要。

目前，偽狂犬病的診斷方法有很多種，其中g(shù)E-ELISA方法和gB-ELISA常用于豬群的免疫抗體監(jiān)測(cè)和預(yù)警，PCR方法和熒光定量PCR則是病原學(xué)診斷的主要方法[4]。PCR-LFD技術(shù)是將PCR技術(shù)、核酸探針雜交技術(shù)與橫向流動(dòng)試紙條(lateral flow dipstick,LFD)三項(xiàng)技術(shù)相結(jié)合，應(yīng)用試紙條直接檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)已在結(jié)核分支桿菌[5]、甲型H1N1病毒[6]、乙型肝炎病毒[7]、轉(zhuǎn)基因黑曲霉[8]、口蹄疫病毒[9]等方面有了成功應(yīng)用的報(bào)道。本研究根據(jù)豬偽狂犬病病毒的gE基因設(shè)計(jì)一套引物和探針，建立了豬偽狂犬病病毒的PCR-LFD特異性檢測(cè)方法，為偽狂犬病的診斷提供了一種更為便捷的病原檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病毒株和菌株 豬偽狂犬病病毒(PRV)SC株，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬烈性傳染病創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)贈(zèng)送；豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬流感病毒(SIV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)R13028株、豬偽狂犬病病毒(PRV)R13139株、豬肺炎支原體(MP)、副豬嗜血桿菌(Hps)均由天津市畜牧獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)室保存；豬鏈球菌2型(SS2)、豬偽狂犬病病毒(PRV)MinA株購(gòu)自國(guó)家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；豬偽狂犬病病毒Bartha-K61株(PRV gE基因缺失株)、日本腦炎病毒(JEV)、豬瘟病毒(CSFV)疫苗株為市售疫苗。

1.1.2 主要試劑 rTaqDNA聚合酶、dNTP、2XGCbuffer I、DNA Marker DL 2 000，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；核酸提取試劑盒，金瑞鴻捷生物科技有限公司產(chǎn)品；橫向流動(dòng)試紙條，杭州憂思達(dá)生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中豬偽狂犬病病毒gE基因(GenBank：AY173124)中的一段保守核苷酸序列，采用Primer Preimer5.0軟件設(shè)計(jì)特異性PCR引物和探針，由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

1.2.2 PCR-LFD方法的建立

1.2.2.1 PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 PCR反應(yīng)體系為20 μL：10 μL 2×GC buffer I，0.5 μL rTaqDNA聚合酶(8 U/μL)，2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)，1 μL PRV gE247(10 μmol/L)，1 μL PRV gE623(10 μmol/L)，5.0 μL模板DNA，0.5 μL超純水。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃至60℃ 30 s，72℃ 30 s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃ 5 min。

1.2.2.2 退火溫度的優(yōu)化 固定其他條件不變，設(shè)定53、54、55、56、57、58、59、60℃共8個(gè)溫度梯度，分別進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立空白水對(duì)照。PCR反應(yīng)結(jié)束，取8 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀上觀察并記錄結(jié)果。

1.2.2.3 引物濃度的優(yōu)化 經(jīng)上述篩選出最佳退火溫度后，固定反應(yīng)體系其他試劑的添加量，對(duì)引物濃度用量設(shè)定為0.5 μL、1 μL、1.5 μL、2 μL，并設(shè)立空白水對(duì)照。反應(yīng)結(jié)束，用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

1.2.2.4 探針雜交反應(yīng)條件優(yōu)化 PCR反應(yīng)結(jié)束后，開蓋加入1 μL Prv-T-bio(10 μmol/L)，增加一步雜交反應(yīng)，94℃ 30 s，54℃至60℃ 30 s，4℃ 5 min。復(fù)性溫度選擇54、55、56、57、58、59、60℃分別進(jìn)行雜交，摸索最佳反應(yīng)條件。

1.2.2.5 LFD試紙條檢測(cè)PCR產(chǎn)物 雜交反應(yīng)結(jié)束后，取PCR產(chǎn)物10 μL加入到100 μL緩沖液，混合均勻；將LFD試紙條插入緩沖液3 min；取出將試紙條水平放置，5 min～10 min內(nèi)讀取結(jié)果。判定標(biāo)準(zhǔn)：質(zhì)控線和檢測(cè)線顯現(xiàn)棕紅色條帶，為陽性；只有質(zhì)控線顯現(xiàn)棕紅色條帶，為陰性；只出現(xiàn)檢測(cè)線為無效。

1.2.3 特異性試驗(yàn) 用已優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系檢測(cè)偽狂犬病病毒(PRV)SC株、偽狂犬病病毒(PRV)R13028株、偽狂犬病病毒(PRV)R13193株、偽狂犬病病毒(PRV)MinA株、豬偽狂犬病病毒Bartha-K61 株( PRV gE基因缺失株)、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、日本腦炎病毒(JEV)、豬流感病毒(SIV)、豬肺炎支原體(MP)、副豬嗜血桿菌(Hps)、豬鏈球菌2型(SS2)。探針雜交后，用瓊脂糖凝膠電泳法和LFD分別檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，確定所建立方法的特異性。

1.2.4 敏感性試驗(yàn) 將已知TCID50的偽狂犬病病毒稀釋為105～101個(gè)TCID50，按常規(guī)方法提取DNA，分別取5 μL作為模板，其他反應(yīng)條件不變進(jìn)行PCR擴(kuò)增。探針雜交后，用瓊脂糖凝膠電泳法和LFD分別檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，確定所建立方法的敏感性。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳法和LFD試紙條靈敏度比較 以偽狂犬病病毒SC株DNA為模板，按照優(yōu)化后的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后，測(cè)定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸含量，并用純水做10倍、100倍、1 000倍稀釋。分別取出20 μL稀釋產(chǎn)物，加入1 μL核酸探針，探針雜交反應(yīng)后，用瓊脂糖凝膠電泳法和LFD試紙條分別檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，比較兩種方法的差異。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 采用同一批次和不同批次提取的豬偽狂犬病病毒DNA作為模板分別進(jìn)行5次PCR擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳法和LFD法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，確定所建立PCR-LFD方法的重復(fù)性。

1.3 臨床樣品的檢測(cè)

從養(yǎng)殖場(chǎng)采集50份病料樣品，用病毒分離培養(yǎng)法和PCR-LFD方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的符合率。

2 結(jié)果

2.1 退火溫度的優(yōu)化

選擇53℃～60℃ 8個(gè)復(fù)性溫度進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示56℃和55℃均能擴(kuò)增出特異的目的條帶，而且56℃亮度最強(qiáng)，因此，最終確定56℃為最適反應(yīng)溫度(圖1)。

1～8.60℃、59℃、58℃、57℃、56℃、55℃、54℃、53℃；9.陰性對(duì)照；M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000

1-8.60℃,59℃,58℃,57℃,56℃,55℃,54℃,53℃;9.Negative control;M.DNA Marker DL 2 000

圖1復(fù)性溫度優(yōu)化

Fig.1 Optimization of the annealing temperature

2.2 引物濃度的優(yōu)化

固定PCR體系中其他試劑的添加量，將引物濃度用量設(shè)定為0.5、1、1.5、2 μL分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，加入0.5 μL引物時(shí)，擴(kuò)增條帶稍淺；加入1、1.5、2 μL引物時(shí)，擴(kuò)增條帶均清晰，無明顯引物二聚體，因此，1 μL為最佳引物添加量(圖2)。

1.2 μL引物(陽性對(duì)照)；2.2 μL引物(陰性對(duì)照)；3.1.5 μL引物(陽性對(duì)照)；4.1.5 μL引物(陰性對(duì)照)；5.1 μL引物(陽性對(duì)照)；6.1 μL引物(陰性對(duì)照)；7.0.5 μL引物(陽性對(duì)照)；8.0.5 μL引物(陰性對(duì)照)；M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000

1.2 μL primer(postive control);2.2 μL primer(negnative control);3.1.5 μL primer(postive control);4.1.5 μL (negnative control);5.1 μL primer(postive control);6.1 μL (negnative control);7.0.5 μL primer(postive control);8.0.5 μL (negnative contro);M.DNA Marker DL 2 000

圖2引物濃度優(yōu)化

Fig.2 Optimization of the primer concentration

2.3 探針雜交反應(yīng)條件優(yōu)化

PCR反應(yīng)液中加入標(biāo)記Biotin的探針，復(fù)性溫度選擇54、55、56、57、58、59、60℃分別進(jìn)行雜交，然后用LFD試紙條檢測(cè)，結(jié)果54、59、60℃試紙條檢測(cè)線未出現(xiàn)陽性條帶，55、56、57℃時(shí)檢測(cè)線有明顯陽性帶，但55℃和56℃的檢測(cè)線較淺，57℃檢測(cè)線最為明顯，因此認(rèn)為94℃ 30 s，57℃ 30 s，4℃ 5 min為最佳的探針雜交反應(yīng)程序(圖3)。

1～7.54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃；8.陰性對(duì)照

1-7.54℃,55℃,56℃,57℃,58℃,59℃,60℃;8.Negnative control

圖3探針雜交溫度篩選試驗(yàn)結(jié)果

Fig.3 Temperature screening test results of
probe hybridization reaction

2.4 特異性試驗(yàn)

本試驗(yàn)建立的豬偽狂犬病病毒PCR-LFD檢測(cè)方法檢測(cè)偽狂犬病病毒(PRV)SC株、偽狂犬病病毒(PRV)R13028株、偽狂犬病病毒(PRV)R13193株、偽狂犬病病毒(PRV)MinA株、豬偽狂犬病病毒Bartha-K61株(PRV gE基因缺失株)、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRS)、豬細(xì)小病毒(PPV)、日本乙型腦炎病毒(JEV)、豬流感病毒(SIV)、豬肺炎支原體(MP)、副豬嗜血桿菌(Hps)、豬鏈球菌2型(SS2)。從圖4可見所建立的PCR-LFD方法只能檢測(cè)到偽狂犬病病毒SC株、R13028株、R13139株、MinA株，偽狂犬病病毒Bartha-K61株和其他對(duì)照菌毒株均為陰性，采用瓊脂糖凝膠電泳和試紙條方法觀察的檢測(cè)結(jié)果完全一致。

2.5 敏感性試驗(yàn)

從圖5可見，所建立的PCR方法的最低檢測(cè)病毒滴度為102TCID50/100 μL，且采用瓊脂糖凝膠電泳和試紙條方法的檢測(cè)結(jié)果完全一致。

2.6 瓊脂糖凝膠電泳法和LFD試紙條靈敏度比較

用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定偽狂犬病病毒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸含量為482.5 ng/μL，將其稀釋10倍、100倍、1000倍后，用瓊脂糖凝膠電泳和LFD試紙條分別檢測(cè)，結(jié)果見圖6。從圖中可看出當(dāng)PCR產(chǎn)物稀釋100倍后，已很難通過瓊脂糖凝膠電泳觀察到陽性結(jié)果，但是LFD試紙條仍可見較為清晰的紅色檢測(cè)線。說明LFD試紙條的靈敏度是瓊脂糖凝膠電泳的10倍。

A.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；B.LFD試紙條檢測(cè)；1.偽狂犬病病毒SC株；2.偽狂犬病病毒MinA株；3.偽狂犬病病毒R13028株；4.偽狂犬病病毒R13139株；5.偽狂犬病病毒Bartha-K61 株(gE)；6.豬圓環(huán)病毒2型；7.豬瘟病毒；8.日本乙型腦炎病毒；9.細(xì)小病毒；10.豬繁殖與呼吸綜合征病毒；11.豬流感病毒；12.豬肺炎支原體；13.副豬嗜血桿菌；14.豬鏈球菌2型；15.空白對(duì)照；M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000

A.Agarose gel electrophoresis; B.LFD strips; 1.PRV SC strain;2.PRV MinA strain;3.PRV R13028 strain;4.PRV R13139;5.PRV Bartha-K61 strain(gE-);6.PCV-2;7.CSFV;8.JEV;9.PPV;10.PRRSV;11.SIV;12.MP;13.Hps;14.SS2;15.Negnative control;M.DNA Marker DL 2 000

圖4 PCR特異性試驗(yàn)

Fig.4 Specificity test of PCR

A.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；B.LFD試紙條檢測(cè)；1.陰性對(duì)照；2～6.101 TCID50～105 TCID50；M. DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000A.Agarose gel electrophoresis; B.LFD strips; 1.Negnative control;2-6.101 TCID50-105 TCID50;M.DNA Marker DL 2 000

A.瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；B.LFD試紙條檢測(cè)；1.陰性對(duì)照；2～4.103,102,10稀釋的PCR產(chǎn)物；5.原倍PCR產(chǎn)物；M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000

A.Agarose gel electrophoresis; B.LFD strips; 1.Negnative control; 2-4.PCR products diluted 103,102,10 times; 5.The original time PCR procucts; M.DL 2 000 DNA Marker

圖6瓊脂糖凝膠電泳法與LFD試紙條法靈敏度比較試驗(yàn)

Fig.6 The sensitivity comparison of agar gel electrophoresis and LFD strips analysis

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一次和不同時(shí)間提取的豬偽狂犬病病毒DNA各5份，將其作為模板進(jìn)行5次PCR擴(kuò)增，用LFD試紙條和瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，兩種方法結(jié)果完全一致，說明所建立的PCR-LFD方法具有良好的重復(fù)性。

2.8 臨床樣品的檢測(cè)

對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的50份病料樣品用PCR、病毒分離培養(yǎng)法和PCR-LFD方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果PCR檢測(cè)到14份陽性，而病毒分離培養(yǎng)法和PCR-LFD方法為16份，PCR-LFD方法的敏感性要高于常規(guī)PCR方法。從表2可見PCR-LFD方法與病毒分離培養(yǎng)法的符合率為100%，與常規(guī)PCR方法的陽性符合率為100%，陰性符合率為94.4%。用SPSS17.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，PCR-LFD方法與PCR的χ2為0.1904，P>0.05，兩種方法無顯著差別。

表2 兩種方法檢測(cè)結(jié)果比較

3 討論

豬偽狂犬病是危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的重要傳染病之一。對(duì)豬偽狂犬病病毒進(jìn)行快速、及時(shí)、準(zhǔn)確的診斷，是有效防控該病的重要前提。偽狂犬病病毒gE基因是其主要毒力決定因子，為病毒復(fù)制的非必需基因，也是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)所規(guī)定基因缺失疫苗的缺失基因。以gE序列作為靶序列建立的診斷技術(shù)，能夠區(qū)分基因缺失疫苗接種與野毒感染[3]。王香玲等[10]根據(jù)豬偽狂犬病病毒gE基因序列保守區(qū)段，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了可區(qū)分豬偽狂犬病病毒野毒株與基因缺失疫苗株的PCR檢測(cè)方法，該方法的敏感性為1.1 pg，有較高的特異性。張志等[11]建立了能夠特異性檢測(cè)PRV野毒株的套式PCR方法，該方法檢測(cè)極限可達(dá)10個(gè)病毒拷貝/μL。田云等[12]建立檢測(cè)偽狂犬病病毒野毒的熒光定量PCR方法，該方法的靈敏度可達(dá)4拷貝。常規(guī)PCR方法檢測(cè)成本低，但需要瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，且有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。熒光定量PCR雖然敏感性高于PCR，可實(shí)時(shí)觀看檢測(cè)結(jié)果，但是需要昂貴的設(shè)備和試劑成本，不適用于基層實(shí)驗(yàn)室和規(guī)模化豬場(chǎng)使用。

本研究建立了一種基于豬偽狂犬病病毒gE基因的PCR-LFD檢測(cè)方法，該方法是將PCR技術(shù)與LFD試紙相結(jié)合的一種可視化檢測(cè)方法，在引物設(shè)計(jì)時(shí)將一條引物標(biāo)記了異硫氰酸熒光素(FITC)，在PCR反應(yīng)后，體系中加入了一條標(biāo)記生物素(Biotin)的探針，只有目的基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物才能與探針結(jié)合。采用試紙條對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，雜交形成的復(fù)合體帶有Biotin和FITC兩種標(biāo)記，用試紙條檢測(cè)時(shí)檢測(cè)線和質(zhì)控線均出現(xiàn)棕紅色條帶。陰性PCR產(chǎn)物、假陽性PCR和引物二聚體不具有雙重標(biāo)記，不能與檢測(cè)線結(jié)合，檢測(cè)線不顯色。該方法在PCR擴(kuò)增后15 min內(nèi)即可目測(cè)判定結(jié)果，與傳統(tǒng)凝膠電泳法相比更快速，且避免使用溴化乙錠(EB)等核酸染料造成的環(huán)境污染[8]。

為了避免PCR結(jié)果出現(xiàn)假陽性，本研究在PCR擴(kuò)增完成以后，增加了特異性探針雜交反應(yīng)，進(jìn)一步提高了該方法的特異性。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可特異性檢測(cè)豬偽狂犬病病毒野毒株，與缺失gE基因的Bartha-K61株和其他9種豬病病原無交叉反應(yīng)。此外，對(duì)比LFD試紙條法和瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果的靈敏度發(fā)現(xiàn)，PCR-LFD方法的最低檢測(cè)限度為100TCID50/100 μL，其敏感性比應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳方法高10倍。

針對(duì)2011年以來流行的豬偽狂犬病病毒變異株分子特征發(fā)生變化的特點(diǎn)，在試驗(yàn)中分別對(duì)偽狂犬病病毒經(jīng)典強(qiáng)毒雙城株(SC株)和閩A株(MinA株)，新分離的豬偽狂犬病變異強(qiáng)毒R13139和R13028株，以及豬偽狂犬病病毒缺失gE基因的疫苗株Bartha-K61進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果僅Bartha-K61株檢測(cè)結(jié)果為陰性，其他4株P(guān)RV檢測(cè)結(jié)果均為陽性，表明建立的方法適用于PRV經(jīng)典強(qiáng)毒和變異的強(qiáng)毒株的檢測(cè)。

以上結(jié)果表明，本研究建立的偽狂犬病病毒PCR-LFD檢測(cè)方法具有敏感、快速、特異等特點(diǎn)，且操作簡(jiǎn)便、無需電泳可直接觀察結(jié)果，可用于實(shí)驗(yàn)室、養(yǎng)殖場(chǎng)和基層獸醫(yī)部門對(duì)偽狂犬病的診斷和監(jiān)測(cè)預(yù)警，具有廣闊的應(yīng)用前景。