大黃素對(duì)腹膜透析大鼠腹膜纖維化的抑制作用及機(jī)制

程錦繡 郝軍榮 劉翠蘭 王琳琳 衛(wèi)志鋒 劉圣君 劉華

1河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院腎內(nèi)科（河北張家口 075000）；2河北北方學(xué)院藥理教研室（河北張家口075000）

腹膜透析為腎衰竭治療的方法之一。有研究指出，長(zhǎng)期進(jìn)行腹膜透析過程中可出現(xiàn)腹膜炎癥及腹膜結(jié)構(gòu)進(jìn)展性的損傷［1］，進(jìn)而發(fā)展為腹膜纖維化，導(dǎo)致患者退出腹膜透析治療。由于腹膜纖維化的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，此前治療針對(duì)性不強(qiáng)，給腹膜纖維化的治療造成障礙［2］，因此，探究腹膜纖維化的病理機(jī)制及治療方法為臨床研究的難點(diǎn)。大黃素為大黃的主要活性成分，其具有抗腫瘤、抗炎等活性。研究表明，大黃素在腎纖維化、胰腺纖維化、心室纖維化的治療中表現(xiàn)出較好的作用［3-5］，因此推測(cè)其對(duì)腹膜纖維化具有一定抑制作用。目前關(guān)于大黃素對(duì)腹膜纖維化的研究較少且國(guó)內(nèi)未對(duì)大黃素治療腹膜纖維化的有效劑量進(jìn)行探討，因此本研究建立腹膜纖維化大鼠模型，研究其對(duì)大鼠腹膜纖維化的相關(guān)機(jī)制并對(duì)其劑量簡(jiǎn)要分析。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料大黃素（廣東中山康之源生物科技有限公司）以生理鹽水配制成35 mg/kg的工作液；采用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)Notch1、Jagged-1、Hes-1、β-actin引物序列（表1）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用3個(gè)月齡雄性SD大鼠，購自河北大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基、胰酶、雙抗（美國(guó)Gibico）；RT-PCR試劑盒（日本Takara）；大鼠PⅢNP試劑盒（美國(guó)賽默飛）；Notch1試劑盒、Jagged-1試劑盒、Hes-1試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）；一抗及二抗稀釋液、辣根過氧化物酶連接的二抗（上海生工生物工程）；TRIZOL RNA提取試劑盒（上海閃晶分子生物科技有限公司）。儀器包括低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo）；RT-PCR儀（美國(guó) ABI）；酶標(biāo)儀（美國(guó) BioTek）；恒溫CO2培養(yǎng)箱（蘇州凈化有限公司）；石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)（德國(guó)SLEE）。

表1 引物序列Tab.1 Primers sequence

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1腹膜纖維化大鼠模型入選大鼠每日腹腔注射4.25%葡糖糖透析液（100 mL/kg），建立腹膜纖維化模型［6］。將造模成功大鼠隨機(jī)分為B組、C組、D組，每組10只，選取10只未造模大鼠為空白對(duì)照組（A組）。B組大鼠培養(yǎng)3周后處死、C組培養(yǎng)6周后處死，D組在造模開始時(shí)腹腔注射大黃素（根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為35mg/kg），與C組同時(shí)處死。

1.2.2腹膜纖維化大鼠超濾量、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量腹膜透析結(jié)束后24 h，將大鼠麻醉腹腔注射4.25%葡糖糖透析液，5 h后，量取腹腔液體，同時(shí)留取大鼠透析結(jié)束0 h及5 h血液標(biāo)本，測(cè)定葡萄糖濃度。超濾量：最后出水量-25 mL；葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量計(jì)算公式：葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量（mmol/kg）=（初始葡糖糖濃度×透析液體積）-（結(jié)束葡糖糖濃度×結(jié)束透析液出量）。

1.2.3腹膜組織學(xué)變化分別于3、6周處死大鼠，留取壁層和臟層腹膜，石蠟包埋連續(xù)切片，厚度為5 μm，HE染色。

1.2.4腹膜厚度觀察石蠟包埋連續(xù)切片，厚度5 μm，常規(guī)脫水后，經(jīng)天青石、鐵蘇木、麗春紅酸性品紅、1%磷鉬酸、冰醋酸分化，亮綠染色，經(jīng)95%酒精脫水，樹膠封片，Masson染色，觀察腹膜厚度。

1.2.5大鼠腹膜組織Notch1、Jagged-1、Hes-1 mRNA表達(dá)水平檢測(cè)液氮研磨腹膜組織，加入Trizol提取總RNA。取總RNA 5 μL，80 ℃水浴5 min加入反轉(zhuǎn)錄液，45℃孵育72 min，留取產(chǎn)物待用。擴(kuò)增參數(shù)，95℃變性10.5 min，60℃退火50 s，72℃延伸50 s，40個(gè)循環(huán)后，72℃最終延伸10 min，10℃最終保存。

1.2.6大鼠腹膜組織Notch1、Jagged-1、Hes-1蛋白的表達(dá)檢測(cè)取腹膜組織，加入適量的RIPA裂解液和PMSF（100∶1）裂解壁層腹膜組織，4℃下3 000 r/min離心，取上清液置于-20℃冰箱。BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定各蛋白濃度。

1.2.7PⅢNP水平檢測(cè)收集大鼠血漿標(biāo)本，采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血漿PⅢNP水平。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1大鼠組織病理學(xué)變化HE染色顯示，A組壁層腹膜表面有一層扁平排列的細(xì)胞，B組可見腹膜表面細(xì)胞呈圓形、橢圓形，有脫落細(xì)胞，C組腹膜組織細(xì)胞明顯脫落，纖維顯現(xiàn)（圖1）。Messon染色顯示，A組腹膜組織較薄且呈連續(xù)分布，隨時(shí)間推移，腹膜厚度增加，同時(shí)可見膠原沉積加重（圖2）。

2.2各組大鼠超濾量、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量、腹膜厚度及PⅢNP的變化B組、C組大鼠的超濾量降低，PⅢNP、腹膜厚度及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量升高，變化幅度均高于A組（P＜0.05）；D組大鼠超濾量高于C組（P＜0.05），葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量、腹膜厚度及PⅢNP低于C組（P＜0.05）。見表2。

2.3大黃素對(duì)大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1蛋白表達(dá)的影響C組大鼠3種蛋白的表達(dá)量明顯增多；D組與C組相比，蛋白水平降低（P＜0.05）。見表3、圖3。

圖1 HE染色Fig.1 HE staining

圖2 Masson染色Fig.2 Masson staining

表2 大鼠超濾量、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量、腹膜厚度及血清PⅢNP的變化Tab.2 Changes in ultrafiltration volume，glucose transport volume，peritoneal thickness and serum PIIINP in model rats ±s

表2 大鼠超濾量、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量、腹膜厚度及血清PⅢNP的變化Tab.2 Changes in ultrafiltration volume，glucose transport volume，peritoneal thickness and serum PIIINP in model rats ±s

注：與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，△P＜0.05

組別A組B組C組D組超濾量（mL）4.93±0.56 2.68±0.43*1.72±0.22*2.52±0.25*△腹膜厚度（μm）13.93±2.36 21.33±3.26*45.18±3.94*25.18±4.34*△PⅢNP（mg/mL）7.62±1.51 21.16±4.77*30.01±5.21*23.51±3.21*△葡萄糖準(zhǔn)運(yùn)量（mmol/kg）14.10±2.25 17.75±4.37*19.03±5.14*18.22 ± 5.10*△

表3 大黃素對(duì)大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1蛋白表達(dá)的影響Tab.3 Effect of emodin on the expression of Notch1，Jagged-1 and Hes-1 protein in rats ± s，%

表3 大黃素對(duì)大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1蛋白表達(dá)的影響Tab.3 Effect of emodin on the expression of Notch1，Jagged-1 and Hes-1 protein in rats ± s，%

注：與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05

組別A組C組D組Notch1 101.55±24.34 174.24±50.28*109.85±19.43#Jagged-1 102.99±26.61 247.75±47.43*106.29±20.81#Hes-1 97.98±30.44 145.36±26.78*108.83±31.57#

圖3 大黃素對(duì)模型大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of emodin on the expression of Notch1，Jagged-1 and Hes-1 protein in model rats

2.4大黃素治療后，模型大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1 mRNA表達(dá)的變化C組、D組3種mRNA表達(dá)高于A組，其中D組上升幅度低于C組（均P＜ 0.05）。見表4、圖4。

表4 大黃素對(duì)模型大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1 mRNA表達(dá)的影響Tab.4 Effect of emodin on the expression of Notch1，Jagged-1 and Hes-1 mRNA in model rats ± s，%

表4 大黃素對(duì)模型大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1 mRNA表達(dá)的影響Tab.4 Effect of emodin on the expression of Notch1，Jagged-1 and Hes-1 mRNA in model rats ± s，%

注：與A組比較，*P＜0.05；與C組比較，#P＜0.05

組別A組C組D組Notch1 103.42±26.84 347.84±52.18*263.85±42.33*#Jagged-1 105.28±33.26 224.73±47.83*148.09±30.21*#Hes-1 99.86±32.04 264.26±52.38*150.38±44.37*#

圖4 大黃素對(duì)模型大鼠Notch1、Jagged-1、Hes-1 mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Effect of emodin on the expression of Notch1，Jagged-1 and Hes-1 mRNA in model rats

3 討論

腹膜纖維化的形成由多種病因共同作用，大量研究表明，透析液中高糖、高滲、pH值以及反復(fù)發(fā)作的細(xì)菌性腹膜炎均參與腹膜纖維化的發(fā)生發(fā)展過程［7-8］。腹膜纖維化為導(dǎo)致腹膜透析技術(shù)失敗的常見原因，因此明確腹膜纖維化的發(fā)病機(jī)制對(duì)了解腹膜纖維化過程并進(jìn)行干擾、預(yù)防成為當(dāng)前臨床研究的熱點(diǎn)之一。本研究通過建立腹膜纖維化大鼠模型，觀察模型大鼠生理特征及特定蛋白的表達(dá)，并給予模型大鼠大黃素治療，探討引起大鼠腹膜纖維化的機(jī)制及藥物治療的效果。目前臨床常見的造模方法有細(xì)菌性腹膜炎致腹膜纖維化、化學(xué)性腹膜炎致腹膜纖維化、轉(zhuǎn)基因技術(shù)致腹膜纖維化及本研究采用的非生物相容性腹膜透析液致腹膜炎［9］。研究指出，細(xì)菌性、化學(xué)性腹膜炎造模方法產(chǎn)生的不良反應(yīng)較多，而且其與實(shí)際腹膜纖維化發(fā)病的機(jī)制存在差異，因此不能滿足研究需要；轉(zhuǎn)基因技術(shù)造模技術(shù)要求較高，且其并未考慮腹膜纖維化形成的基本因素，因此在臨床應(yīng)用中并不理想［10］。本研究中所用方法考慮了導(dǎo)致腹膜纖維化的基本因素，更加符合臨床實(shí)際［11］。本研究中從造模第3周起，發(fā)現(xiàn)模型大鼠超濾量明顯降低，而葡糖糖轉(zhuǎn)運(yùn)量、腹膜厚度、及PⅢNP水平明顯升高，在造模第6周，以上指標(biāo)改變更加明顯。

近來有研究指出，腹膜纖維化大鼠的纖維化及超濾功能可被PKC抑制劑及基因敲除所逆轉(zhuǎn)，同時(shí)，可明顯降低促炎、促纖維化等介質(zhì)的生成［12］。腹膜纖維化引起的的超濾功能損傷已成為腹膜透析患者退出治療的主要原因［13］。因此，保護(hù)間皮細(xì)胞層的功能是保障腹膜透析患者進(jìn)行治療預(yù)后的關(guān)鍵［14］。大量研究證實(shí)，一些細(xì)胞因子信號(hào)通路的激活為造成腹膜纖維化的重要途徑［15］。本研究表明，Notch1信號(hào)通路明顯激活，主要表現(xiàn)為在造模3周時(shí)，Notch1、Jagged-1、Hes-1等Notch1信號(hào)蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，在造模6周達(dá)到頂峰；同時(shí)，本研究對(duì)造模大鼠進(jìn)行大黃素治療，結(jié)果表明，模型大鼠的超濾量明顯增加，腹膜增厚及膠原沉積明顯改善，葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量及PⅢNP水平也明顯下降，提示，大黃素改善腹膜纖維化可能與調(diào)節(jié)Notch通路相關(guān)。

綜上所述，本研究探討了大黃素治療腹膜纖維化的機(jī)制，為進(jìn)一步解釋腹膜纖維化的機(jī)制提供了證據(jù)，同時(shí)為治療腹膜纖維化提供了新的靶點(diǎn)及治療藥物，下一步筆者將對(duì)大鼠進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的觀察，評(píng)價(jià)其生存質(zhì)量并探討不同劑量大黃素對(duì)腹膜纖維化大鼠的治療作用，尋找最佳治療劑量。