利拉魯肽與艾塞那肽對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)小鼠高血壓心臟纖維化的影響

郭清 王靜

1青海婦女兒童醫(yī)院（西寧 810000）；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院（鄭州 450052）

高血壓、缺血性心肌損傷等心臟疾病中均可見心臟纖維化，具體表現(xiàn)為心肌細(xì)胞壞死、心肌細(xì)胞間隙原纖維沉積等，可引發(fā)心臟重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致心臟功能下降［1］。在高血壓導(dǎo)致的心臟纖維化中，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）有重要作用，可促使血管平滑肌收縮，并誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，因此，現(xiàn)階段，臨床上對(duì)高血壓患者心臟功能實(shí)施保護(hù)與研究時(shí)，多以AngⅡ抑制為對(duì)象進(jìn)行［2］。關(guān)于此方面的研究，當(dāng)前臨床上多展開胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動(dòng)劑效果的方面的研究，但對(duì)兩種常見GLP-1受體激動(dòng)劑的研究較少。近年來(lái)，GLP-1受體激動(dòng)劑逐漸被用于心臟疾病治療，為進(jìn)一步探討其對(duì)AngⅡ誘導(dǎo)高血壓心臟纖維化小鼠模型的作用，本次研究以40只小鼠為對(duì)象，分組予以不同干預(yù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)資料（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。C57BL/6J小鼠共40只，均為雄性，周齡為8周，體質(zhì)量22～26 g，由北京維通利化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。（2）藥物。利拉魯肽注射液購(gòu)自丹麥諾和諾德公司，規(guī)格0.25 mL，批準(zhǔn)文號(hào)：J20160037；艾塞那肽注射液購(gòu)自美國(guó)Baxter Pharmaceutical Solutions LLC，規(guī)格18 mg/3 mL，批準(zhǔn)文號(hào)：H20140822；AngⅡ購(gòu)自美國(guó)sigma公司，批準(zhǔn)文號(hào)：HZB0537；植入式膠囊滲透壓泵購(gòu)自成都醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：ALZET MODEL 2004。（3）儀器。小鼠測(cè)壓儀購(gòu)自日本Softron公司，型號(hào)Softron BP-98A；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自日本PLYMPPUS，型號(hào)IX71-SIF；病理圖像分析為Image-ProPlus6.0，由美國(guó)Cybernetics公司提供；小動(dòng)物高分辨超聲儀由建安Visual Sonics公司提供，型號(hào)是Visual Sonics Vevo770。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物模型建立（1）選取80只健康雄性小鼠，試驗(yàn)期間自由飲水、進(jìn)食，控制飼養(yǎng)環(huán)境溫度為20～24℃，控制濕度為45%～55%，自然晝夜光照，予以普通飼料、水，1周后，分組：隨機(jī)將40只小鼠分為4組：A組、B組、C組、D組各10只。（2）依據(jù)分組于膠囊滲透壓泵中置入不同實(shí)驗(yàn)試劑。每個(gè)滲透壓泵內(nèi)液體控制為240 μL，灌裝后，置入生理鹽水中，并控制溫度為37℃，置入孵育箱過夜。（3）對(duì)小鼠實(shí)施麻醉后，于頸部進(jìn)行備皮與消毒，于背部順肩胛骨下緣切開皮膚，于左側(cè)背部皮下埋置入膠囊滲透壓泵，通過恒速釋放的方式釋放試劑，共28 d。A組給予生理鹽水；B組給予AngⅡ，1.44 mg/（kg·d）；C組給予AngⅡ+利拉魯肽，AngⅡ劑量1.44 mg/（kg·d），術(shù)前72 h于腹腔內(nèi)注射給予利拉魯肽，0.4 mg/（kg·d）；D組AngⅡ+艾塞那肽，AngⅡ劑量1.44 mg/（kg·d），術(shù)前72 h通過腹腔注射予以艾塞那肽，0.1 mg/（kg·d）。（4）28 d后，安樂死處理小鼠，留取心臟組織標(biāo)本。

1.2.2超聲心動(dòng)圖檢查予以小鼠麻醉，于胸前備皮，通過動(dòng)物高分辨超聲儀展開檢查，測(cè)定左心室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、左心室舒張末徑（LVIDd）、左心射血分?jǐn)?shù)（LVEF）、左心室短軸縮短率（LVFS），測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。

1.2.3組織病理學(xué)檢查取4組小鼠心臟標(biāo)本，置入多聚甲醛溶液，3～5 d，通過流水沖洗，脫水，以石蠟包埋，切片，控制切片厚度為5 μm，置入65℃的烤箱中烘烤，30 min～1 h，展開脫蠟至水處理。常規(guī)行HE染色、Masson染色。

1.2.4Western-blot檢測(cè)通過Western-blot檢測(cè)4組小鼠心肌中Ⅰ、Ⅲ型膠原水平。

1.3觀察指標(biāo)（1）心功能指標(biāo)：LVIDs、LVIDd、LVEF、LVFS。（2）心肌結(jié)構(gòu)：HE染色結(jié)果。（3）心肌纖維化情況：Masson染色結(jié)果。（4）4組小鼠心肌中Ⅰ、Ⅲ型膠原水平。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法研究涉及數(shù)據(jù)行統(tǒng)計(jì)分析前均通過K0lmogorov-Smirnov展開檢驗(yàn)，以四格表、PXC表卡方檢驗(yàn)對(duì)分類資料進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)于數(shù)量較低的指標(biāo)，通過Fisher實(shí)施檢驗(yàn)。以t對(duì)定量資料實(shí)施檢驗(yàn)，若方差不齊，予以校正t檢驗(yàn)，水平因素較多時(shí)通過F進(jìn)行檢驗(yàn)，組間多重對(duì)比通過S-N-K進(jìn)行檢驗(yàn)，通過SPSS 21.0軟件展開數(shù)據(jù)分析工作，結(jié)果顯示P＜0.05，表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1對(duì)比4組超聲心動(dòng)圖檢查情況超聲心動(dòng)圖檢查發(fā)現(xiàn)，A組小鼠心腔結(jié)構(gòu)處于正常狀態(tài)，可見有力的壁室運(yùn)動(dòng)；B組小鼠胸腔擴(kuò)大，心臟結(jié)構(gòu)可見“球形變”，壁室運(yùn)動(dòng)減慢，心肌回聲增強(qiáng)；C、D兩組小鼠心臟超聲表現(xiàn)介于A組、B組之間，見圖1。A組小鼠LVIDs、LVIDd較B組、C組、D組低，LVEF、LVFS較B組、C組、D組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組、D組LVIDs、LVIDd低于B組，LVEF、LVFS高于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C、D兩組 LVIDs、LVIDd、LVEF、LVFS對(duì)比則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 4組相關(guān)心功能指標(biāo)對(duì)比Tab.1 Comparison of the functional indexes of four groups±s

表1 4組相關(guān)心功能指標(biāo)對(duì)比Tab.1 Comparison of the functional indexes of four groups±s

注：與A組比較，#P＜0.05；與B組對(duì)比較，*P＜0.05

組別A組B組C組D組F值P值例數(shù)20 20 20 20 LVIDs（mm）3.48±0.25 4.65±0.28 3.57±0.27 3.56±0.26 6.981 0.021 LVIDd（mm）1.55±0.14#3.01±0.18#2.02±0.23#2.03±0.21#8.101 0.015 LVEF（%）86.62±2.25#*65.32±3.27#*76.29±2.96#*75.98±2.89#*6.237 0.032 LVFS（%）55.01±1.24#*35.49±2.35#*45.10±1.23#*45.12±1.20#*5.368 0.393

2.2對(duì)比4組心臟結(jié)構(gòu)相較于A組，B組小鼠心臟的室壁較厚，心室腔可見擴(kuò)大，C、D兩組與A組對(duì)比則無(wú)明顯差異，但相較于B組，C、D兩組小鼠均可見心室厚度下降，心腔縮小。于光學(xué)顯微鏡下實(shí)施檢查，可見A組小鼠心肌細(xì)胞整齊排列，呈條形，細(xì)胞漿為紅色，肌橫紋清晰，可見明顯的心肌細(xì)胞間隙。B組小鼠心肌細(xì)胞排列紊亂，胞漿成分增多，細(xì)胞間隙縮小。C、D兩組小鼠心肌細(xì)胞排列較為規(guī)整，但相較于A組細(xì)胞體積增大、間隙縮小。見圖2。

2.3對(duì)比4組心肌纖維化情況A組小鼠心肌纖維整齊排列，有規(guī)則，細(xì)胞間隙可見少量藍(lán)色的膠原纖維散在。相較于A組，B組小鼠心肌細(xì)胞排列無(wú)序，細(xì)胞間隙中可見大量藍(lán)色的膠原纖維；C、D兩組小鼠心肌細(xì)胞間隙中的藍(lán)色膠原纖維少于B組，見圖3、4。

2.4對(duì)比4組小鼠心肌中Ⅰ、Ⅲ型膠原水平B組小鼠心肌中Ⅰ、Ⅲ型膠原水平較A組、C組、D組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），C、D兩組對(duì)比則差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖5。

圖1 4組小鼠超聲心臟結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Ultrasonic cardiac structure map of four groups of mice

圖2 4組小鼠HE染色心臟結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Cardiac structure map with HE staining in four groups of mice

圖3 4組小鼠Masson染色心肌纖維化情況圖Fig.3 Four groups of mice with Masson staining of myocardial fibrosis

3 討論

圖4 4組小鼠Masson染色心肌纖維化半定量分析結(jié)果Fig.4 The results of semi quantitative analysis of myocardial fibrosis in the four groups of mice with Masson staining

圖5 4組小鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原水平對(duì)比Fig.5 Comparison ofⅠandⅢcollagen levels in groups of four groups of mice

3.1AngⅡ與高血壓心臟纖維化近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外高血壓發(fā)生率均呈上升趨勢(shì)，由高血壓導(dǎo)致的心臟疾病也不斷增多，可引發(fā)心力衰竭。關(guān)于心力衰竭病理學(xué)的研究結(jié)果［3］顯示，心力衰竭病理特點(diǎn)主要為心肌細(xì)胞肥大、心肌組織纖維化等。其中，高血壓引發(fā)的心力衰竭患者中，心肌組織纖維化改變尤為突出［4］。在高血壓引發(fā)的心臟疾病中，心臟纖維化具體表現(xiàn)為心臟順應(yīng)性下降、心臟舒張功能出現(xiàn)障礙等。而在心臟纖維化改變中，AngⅡ發(fā)揮著主導(dǎo)作用，可直接與細(xì)胞表面的AT1R結(jié)合，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，并對(duì)生長(zhǎng)因子產(chǎn)生誘導(dǎo)作用，促使其轉(zhuǎn)化，間接導(dǎo)致心臟發(fā)生纖維化改變［5］。

3.2AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓心臟纖維化小鼠模型中利拉魯肽、艾塞那肽的作用利拉魯肽、艾塞那肽均屬于GLP-1，GLP-1由小腸分泌，是一種腸促胰島素激素，對(duì)人體餐后血糖的維持有重要作用，但在人體內(nèi)，內(nèi)源性的GLP-1半衰期極短，僅為1～2 min，釋放后即可快速被分解［6］。當(dāng)前，GLP-1類似物不斷被研發(fā)與應(yīng)用，利拉魯肽、艾塞那肽即為其中常見的兩種，被廣泛應(yīng)用于2型糖尿病的治療。近年來(lái)，臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽、艾塞那肽除了能夠?qū)ρ沁M(jìn)行控制外，還具有降低血壓、血脂、改善血管內(nèi)皮功能、抑制心臟纖維化等多方面的作用［7］。

本次研究結(jié)果顯示，相較于予以AngⅡ的小鼠，給予AngⅡ+利拉魯肽、AngⅡ+艾塞那肽的小鼠血壓均較低，LVIDs、LVIDd、LVEF、LVFS均較優(yōu)越，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果表明：利拉魯肽與艾塞那肽均具有控制血壓的效果，機(jī)制可能如下：（1）對(duì)血管內(nèi)皮功能進(jìn)行改善。（2）激活血管平滑肌中的GLP-1受體，發(fā)揮舒張血管平滑肌的作用［8］。（3）對(duì)尿鈉排泄產(chǎn)生促進(jìn)作用。（4）控制小腸-腦軸，使體重下降，間接降低血壓［9］。（5）激活中樞神經(jīng)細(xì)胞中的GLP-1受體，使交感神經(jīng)系統(tǒng)張力下降［10-11］。此外，利拉魯肽與艾塞那肽可對(duì)心臟纖維化產(chǎn)生抑制作用，與劉靜芹等［12］研究相似。利拉魯肽與艾塞那肽均可對(duì)心肌細(xì)胞肥大進(jìn)行抑制，使心肌細(xì)胞凋亡減少［13］。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給予AngⅡ+利拉魯肽、AngⅡ+艾塞那肽的兩組小鼠血壓、相關(guān)心功能指標(biāo)、心臟結(jié)構(gòu)、心臟纖維情況對(duì)比缺乏統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），表明兩種藥物在控制血壓、改善心功能、抑制心臟纖維化方面的作用無(wú)明顯差別。

綜上所述，對(duì)于AngⅡ誘導(dǎo)的高血壓心臟纖維化改變，利拉魯肽、艾塞那肽均可產(chǎn)生抑制作用，且二者作用無(wú)明顯差異。但本研究構(gòu)建的小鼠模型樣本量較小，仍需增大樣本量展開進(jìn)一步探討。