分子印跡法-高效液相色譜-串聯(lián)質譜法檢測牛奶中的氨基糖苷類抗生素

◎ 李云輝

（昭通市質量技術監(jiān)督綜合檢測中心，云南 昭通 657000）

通常，牛奶的質量問題在于其中的抗生素殘留以及其他一些人為添加的物質等。即使可以控制人為添加物質的方式來提高牛奶質量，但抗生素的殘留仍無法被有效控制。氨基糖苷類化合物（Aminoglycosides，AGs）是由氨基環(huán)醇、氨基糖以及其他糖類組成的抗生素的總稱。它是一種由氨基糖與氨基環(huán)醇以過氧橋方式連接而形成的苷類。根據氨基糖苷類的結構特點，可分為5種對環(huán)己醇衍生物的分子結構與取代基，且其在實際臨床大多是鏈霉胺衍生物和2-脫氧鏈霉胺衍生物。這類抗生素在治療和預防畜牧類動物的疾病方面有十分顯著的作用，是牛奶中一大類殘留的抗生素來源，其抗菌機制通過阻礙細菌蛋白質的合成來完成，對多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌有顯著的抗菌效果。長期攝入含有此類抗生素的牛奶會在人體內產生富集作用，副作用很大，有可能導致耳毒性以及腎毒性等疾病。

目前的檢測標準方法中牛奶抗生素的檢測多是利用微生物抗體反應的定性檢測方法，沒有對這類化合物直接進行專一檢測和定量。目前，國內外學者對氨基糖苷類抗生素的研究大多集中于種類、結構和在原藥品中的含量檢測，少量有在食品中殘留進行檢測分析研究報道，但前處理都采用離子交換反向吸附固相萃取柱，或者使用親水-親脂平衡固相萃取柱來對待測樣品進行凈化，通過以多空二乙烯基苯為框架結構，雖具備很好的親水性和親脂性和更廣泛的pH值適應性。但是，這兩類方法依舊無法達到很好的效果，選擇性不高，分離效果不佳。

本文提出一種利用分子印跡技術發(fā)展而來的固相萃取柱法，以鏈霉素為模版的方式來實現從復雜基質中對AGs的抗生素進行有效的選擇性分離。以期通過低成本、易操作的技術來實現對氨基糖苷類檢測前處理，再利用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法[1]（HPLC-MS/MS）技術對AGs抗生素在牛奶中的殘留量進行檢測，達到滿意的效果。HPLC-MS/MS通?？梢詸z測牛奶中的β-內酰胺類[2]，四環(huán)素類[3]，大環(huán)內酯類[4]，磺胺類以及氨基糖苷類。對于利用HPLC-MS/MS來對AGs殘留量進行檢測的方法，其前處理要求較高，乳制品樣品的基質復雜，含有大量的內源性化合物會對分析結果產生一定的干擾。

2 實驗中應用到的技術

2.1 HPLC-MS/MS技術的前期處理

HPLC-MS/MS技術成為了現代不可替代的檢測分析技術。HPLC是一種高壓高效液相分離技術，而質譜的操作需要在真空環(huán)境中才能進行；并且在檢測過程中液相色譜通常采用無機鹽，質譜的緩沖劑一般是采用揮發(fā)性的緩沖鹽。為了彌補兩者使用的一些基本物質上的沖突，HPLC-MS/MS技術中采用了大氣壓離子化技術來彌補這一缺陷。

2.2 分子印跡技術

分子印跡技術是一種模板分子技術，即通過分子印跡聚合物和聚合物單體接觸會形成一個多點的作用，并通過這種聚合過程將記憶的作用下降。在模板分子移除后，聚合物會以模板分子空間結構形式來匹配的多點的孔，這些孔將模板分子及其類似物與識別特性的選擇。

其基本步驟如下：①印跡聚合單體的產生。向致孔劑（一種含有模板印跡分子的溶劑）中加入功能單體（常用的有硅氧烷功能單體、偶氮功能單體和復合功能單體），根據共價或非共價作用，使模板分子與功能單體依靠官能團之間產生配合作用，先形成主客印跡聚合單體。②剛性聚合物的形成。加入交聯(lián)劑、反應劑，在引發(fā)劑、光或熱等條件下引發(fā)單體聚合，使主客印跡聚合單體與交聯(lián)劑通過自由基產生共聚合，在模板分子周圍包裹成高聯(lián)的剛性聚合物。③洗脫。將剛性聚合物中的印跡分子通過固相萃取柱洗脫和解離出來。

本文通過使用分子印跡技術進行固相萃取，其分子印跡材料的形成過程如圖1所示。通過分子印跡技術進行固相萃取，可以對目標痕量分析物產生明顯效果的富集作用，即使在基質復雜的情況下也能獲得極佳的選擇性，同時有效分離和模板分子物化性質相似的待測物質，并且此分析方法的表現也具有很高的穩(wěn)定性。

圖1 分子印跡材料的形成基本過程圖

本文主要以鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿普拉霉素和壯觀霉素6種AGs藥物作為研究對象，基于分子印跡固相萃取柱，高效液相色譜-串聯(lián)質譜是AGs的檢測的一種有效方法。部分AGs的分子結構如圖2所示。

圖2 部分AGs的分子結構示意圖

3 實驗內容

3.1 儀器與試劑

1261-6420A高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AB Sciex 5500 QTrap質譜儀（美國Applied Biosystem公司）；Analyst 1.5.1數據釆集及處理系統(tǒng)。壯觀霉素、鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素、阿米卡星（純度大于95%），均采購自Dr. Ehrenstorfer公司（德國）；甲酸（FA）、甲醇（MeOH）和乙腈（ACN）購自Fisher公司（美國）；三氯乙酸（TCA）購自北京檢測試劑限公司（中國）；Oasis HLB和WCX固相萃取柱是用自Waters公司（美國）；實驗室用超純水由MiUipore超純水機制備。0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，50%甲酸-甲醇：將甲酸與甲醇以1∶1體積比混合均勻至l00 mL。50%甲酸-乙腈：將甲酸與甲醇以1∶1體積比混合均勻至l00 mL。

3.2 標準溶液的配制

取一定量標準品配制成l 000 mg/L的標準貯備液，用超純水稀釋成l00 mg/L的混合溶液。然后再將此將混合溶液用超純水進行制成10～5 000μg/L的系列實驗溶液?？瞻谆|溶液：按需量取適量溶液，用空白基質配制成50～5 000 μg/L的空白基質溶液，待凈化。

3.3 目標化合物提取

量取牛奶約5 mL（精確至0.1 mL）放入50 mL具塞離心管中，向其中再加入4 mL的去離子水并使用機器將其進行均勻的混合。加入20 mL乙腈-水（3∶1，V/V）溶液進行高速振蕩2 min后，2 000 r/min再離心8 min，提取上層清夜至另外一支新的雞心瓶中。用10 mL上述溶液重復提取3次，合并上清液于同一雞心瓶中。最后使用0.1 mol/L NaOH將溶液的pH值調為8.5，待凈化。

3.4 樣品凈化

將提取液在45 ℃環(huán)境下旋轉蒸發(fā)至余7 mL左右，并加入2 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，將溶液全部上樣，再利用固相萃取柱進行處理（使用前依次用3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液條件化），然后用3 mL磷酸鹽緩沖液沖洗雞心瓶2次，洗液也移至柱上，用2 mL的初始流動相定容，過濾，待供HPLC-MS/MS分析。

3.5 液相色譜條件

載氣：高純氮氣；碰撞氣：氬氣；源溫度：120 ℃；脫溶劑氣溫度：350 ℃；錐孔電壓（Cone）：18.0 V；毛細管電壓（Capillary）：3.0 kV；溶劑氣體流量：50.0～1 500.0 L/h錐；碰撞電壓（Collision）：31.0 V；檢測模式：電噴霧電離源（ESI）負離子模式，選擇離子檢測模式（SIR）對質荷比（m/z573）定量、子離子檢測（Daughter）定性。色譜柱：ODS柱（ACQUITY UPLC BEH 1.7 μm、2.1×50 mm）， 乙 腈 -0.01% 甲酸溶液（31∶69）為流動相；柱溫40 ℃；流速0.2 mL/min，進樣量：1 μL。色譜柱（150×3 mm，3 μm）；進樣量：30 mL；流動相為甲醇（A）-0.01 mL/L三氟乙酸（B），洗脫梯度：0 min（5.0% A）→5.0 min（30.0% A）→10.0 min（33.5% A）→12.0 min（65.0% A）→17.5 min （65.0% A）→18.0 min（5.0% A）→25.0 min（5.0% A），共25 min。

3.6 質譜條件

電噴霧電離源，多反應監(jiān)測（MRM）；ESI+；氣簾氣（CUR）壓力25 psi，霧化氣壓力60 psi（GSI），輔助氣體壓力為50 psi（GS）、電噴霧電壓4.5 kV，去溶劑溫度（TEM）為500 ℃，碰撞室出口電壓（CXP）為11 V，Q0入口電壓（EP）為15 V。所選6種目標化合物的參數見表1。

表1 六種目標化合物的參數表

4 結果與討論

4.1 色譜柱的選擇

由于氨基糖苷類物質的極性大，常用的反相柱不能有效地保留。因此，想要增強氨基糖苷類抗生素物質在色譜柱上的停留時間，需在流動相中加入一些易揮發(fā)的離子對試劑，如七氯乙酸、三氟乙酸等。而這些離子會殘留在儀器中從而影響到儀器的精確度，會增加維護難度。

本文通過HILIC色譜柱分離樣品，用流動相緩沖氨基糖苷類抗生素的分離和峰形和響應鹽濃度觀察HILIC色譜柱。從圖3中可知，都使用HILIC色譜柱來分離氨基糖苷類抗生素時，阿普拉霉素和慶大霉素的色譜峰有嚴重拖尾的現象，影響積分。而鏈霉素、雙氫鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素的實驗結果表明，想要獲得相對好一些的峰形，可以在流動相中加入較高濃度的緩沖鹽（一般為100～140 mmol/L的甲酸銨）。正如前所述，過高的緩沖鹽濃度揮發(fā)之后會降低響應靈敏度，也會給質譜檢測器帶來一定的污染。因此，本文采用一種氨基柱作為色譜柱。通過使用氨基柱對6種AGs抗生素的分離結果如圖3所示。

圖3 加標樣品中提取的離子色譜圖

4.2 質譜條件的優(yōu)化

由氨基糖苷類抗生素的化學結構可知，該類化合物的分子結構中均含有-OH或者-NH2官能團，在質譜上存在十分強的正離子響應，從而通過ESI+模式的掃描方式可以得到很好的分析結果。首先使用1 mg/kg的單標進行針泵進樣注射分析，正離子模式下用Qi母離子進行全掃描。在質譜正離子模式下，其一級質譜的氨基糖苷[M+2H]2+或[M+H]+分子離子峰，其規(guī)模較大，將分子離子峰選為母離子。之后再對6種AGs的母離子進行二次質譜碎裂，可以得到零散的離子峰的信息。以此推斷出待測樣品的2個特征離子對，并進一步利用這個信息在多反應監(jiān)測（MRM）模式下優(yōu)化去簇電壓和碰撞能量等儀器條件，經優(yōu)化后的6種氨基糖甘類抗生素的質譜參數如表1所示。

4.3 MIP固相萃取柱條件優(yōu)化

由于氨基糖苷類物質的結構中含有-0H或者-NH2，易與H+相結合，因此，上樣液的pH值會對待測樣品在固相萃取柱上的保留造成一定程度的影響。本研究中，考察了不同pH值對待測樣品保留的影響。使用1 mg/kg的混合氨基糖甘類溶液上樣，并提取上樣液，進行測試。實驗結果表明，當上樣液的pH值為7～7.5時，所有待測樣品均無穿透。洗脫溶劑的優(yōu)化考察了濃度為0%、10%、20%、50%，60%、80%甲酸乙腈作為洗脫溶劑時對待測樣品回收率的影響。使用1 mg/kg的氨基糖苷類溶液上樣，提取洗脫液再進行測試。結果表明，當洗脫溶劑中的甲酸乙腈含量為50%時，6種待測樣品的回收率比較可觀。

4.4 方法回收率與精密度

在空白基質中添加3個濃度（50、200、1 000 μg/L）的混合標準溶液，對不同添加濃度標液均做了6次平行測試，得到的結果如表2。從表2中可得，對于卡那霉素、慶大霉素和阿普拉霉素3種AGs而言，利用分子印跡技術的方法其回收率達到50%以上，其精密度（RSD）不到10%。對于鏈霉素和雙氫鏈霉素而言，本方法的回收率分別是30%和40%，且精密度（RSD）也不到10%。對于壯觀霉素SPC，本方法的回收率較低僅為5%～9.5%，而且精密度（RSD）為10%～15%。

表2 方法回收率與精密度結果表

4.5 實際樣品檢測

利用此文中分子印跡技術的方法對本實驗室于2016年5—12月期間的100個乳制品樣品進行AGs藥物的檢測，未檢出AGs。

5 結論

本研究設計的分子印跡固相萃取小柱，能針對牛奶中氨基糖苷類抗生素實現快速、準確、靈敏檢測高效液相色譜-串聯(lián)質譜方法?？疾炝瞬煌盍系墓滔噍腿⌒≈鶎τ谂Ｄ讨?種氨基糖苷類抗生素的凈化效果，相比于商品化的固相萃取柱，自制的固相萃取可以有效地凈化乳基，降低基體效應，提高反應的靈敏度。然而，由于樣品前處理階段的滲透現象仍然存在，希望能夠深入下一步的研究。