桉薄溶液的靶動(dòng)物(雞)安全性試驗(yàn)研究

張 帆，李 晶，劉哲林，呂淑榮

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)中藥研究所，上海 浦東 201203；2.煙臺(tái)綠葉動(dòng)物保健品有限公司，山東 煙臺(tái) 264003)

桉薄溶液是煙臺(tái)綠葉動(dòng)物保健品有限公司自主研發(fā)的3類新獸藥，用于禽用呼吸道疾病的治療[1]，主要成分為桉油和薄荷腦，其中含桉油以桉油精(C10H18O)計(jì)不得少于84.0 mg/mL，含薄荷腦(C10H20O)不得少于88.0 mg/mL。為驗(yàn)證其安全性，采用不同劑量桉薄溶液作用于靶動(dòng)物(雞)，觀察藥物對(duì)靶動(dòng)物(雞)的影響情況，考察桉薄溶液用于靶動(dòng)物(雞)的安全性及安全劑量范圍。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)儀器 Eppendorf(德國(guó))Centrifuge 5417R 高速冷凍離心機(jī)；ACS-電子計(jì)重秤，上海三積分電子有限公司生產(chǎn)；東芝TBA-40FR生化分析儀，株式會(huì)社三廣醫(yī)療生產(chǎn)等。

1.2 試驗(yàn)藥物 桉薄溶液，規(guī)格：100 mL，批號(hào)：110705，煙臺(tái)綠葉動(dòng)物保健品有限公司。

1.3 試驗(yàn)試劑 丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒(速率法)，規(guī)格：液體雙劑型R1：40 mL×3，R2：30 mL×1，批號(hào)：120431，中生北控生物科技股份有限公司；尿素測(cè)定試劑盒(酶偶聯(lián)速率法)，規(guī)格：液體雙劑型R1：50 mL×4，R2：20 mL×2，校準(zhǔn)品：2 mL×1，批號(hào)：120501，中生北控生物科技股份有限公司；總膽紅素測(cè)定試劑盒(釩酸鹽法)，規(guī)格：液體雙劑型 R1：48 mL×4，R2：36 mL×1，校準(zhǔn)品：0.5 mL×1，批號(hào)：110471，中生北控生物科技股份有限公司生產(chǎn)；肌酐測(cè)定試劑盒(苦味酸法)，規(guī)格：液體雙劑型 R1：50 mL×4，R2：20 mL×1，校準(zhǔn)品：2 mL×1，批號(hào)：120371，中生北控生物科技股份有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 AA肉仔雞，7日齡，體重170 g～180 g左右；動(dòng)物來(lái)自濟(jì)南興平養(yǎng)殖合作社；自由采食，飼料購(gòu)自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所飼料廠，飼料中不含任何藥物；試驗(yàn)在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所動(dòng)物房。

2 試驗(yàn)方法

2.1 劑量設(shè)計(jì) 以桉薄溶液對(duì)靶動(dòng)物(雞)的有效劑量作為本試驗(yàn)的低劑量，即雞自由飲水的給藥比例為桉薄溶液∶水=1∶2 500，7日齡的雞按每日50 mL/只平均飲水量計(jì)算，則桉薄溶液應(yīng)灌服0.5 mL/只。以此設(shè)計(jì)3個(gè)劑量組，中劑量和高劑量分別為低劑量的3倍和5倍，見表1。

2.2 動(dòng)物分組及處理 隨機(jī)挑選60只健康的7日齡AA肉雞，按表1進(jìn)行分組處理，所有動(dòng)物處理后均自由飲水和采食。

2.3 觀察指標(biāo) 給藥后，每天觀察各組雞的外觀表現(xiàn)，行為活動(dòng)，精神狀況，糞便，發(fā)病和死亡情況等；每天記錄各組的飲水量和采食量；在試驗(yàn)雞的12日齡和17日齡稱量并記錄各組雞的體重。在12日齡和17日齡的試驗(yàn)雞中，每組隨機(jī)取10只，翅靜脈采血，制備血清樣品，測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(T-Bili)、肌酐(CREA)和尿素氮(BUN)指標(biāo)。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 臨床表現(xiàn) 給藥后，每天觀察各組雞的臨床癥狀，結(jié)果表明，各組雞均精神正常，外觀健康，糞便無(wú)異常，未出現(xiàn)病雞和死亡雞。

3.2 生長(zhǎng)水平

3.2.1 飲水量和采食量 連續(xù)給藥5 d內(nèi)，各組日平均飲水量和5 d的總采食量、總增重量及料肉比見表2。

表1 動(dòng)物的分組及處理

注：(1)各組雞隨機(jī)分配，體重差異不顯著(P>0.05)；(2)高濃度的桉薄溶液適口性較差，為保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，采用口腔灌服給藥的方式

表2 各組雞12日齡的日平均飲水量、總采食量、總增重量和料肉比

注：料肉比=總采食量(kg)/總增重量(kg)。與空白對(duì)照組比較，各組的每日平均飲水量、5 d的料肉比均無(wú)顯著差異(P>0.05)

3.2.2 體重 各組雞在12日齡、17日齡的體重見表3。

表3 各組雞12日齡和17日齡的體重結(jié)果

注：與空白對(duì)照組比較，各組雞在12日齡和17日齡的平均體重均無(wú)顯著差異(P>0.05)

3.3 血生化指標(biāo) 各組雞在12日齡和17日齡血生化指標(biāo)的檢測(cè)結(jié)果見表4和表5。

4 討論

4.1 給藥方式的選擇 預(yù)試驗(yàn)中，各組雞的飲水中分別按比例添加一定的桉薄溶液，雞采取自由飲水的方式給藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)低劑量組(藥物∶水=1∶2 500)，雞的飲水量與空白對(duì)照組的差異不顯著(P>0.05)，且臨床表現(xiàn)正常；中劑量組(藥物:水=1∶833)的雞飲水量較空白對(duì)照組的少，但差異不顯著(P>0.05)；(2)高劑量組(藥物∶水=1∶500)的雞飲水量較空白對(duì)照組的少，且差異顯著(P<0.05)，且大量雞飲水時(shí)出現(xiàn)甩鼻現(xiàn)象。結(jié)果表明，添加有效劑量3倍以上的桉薄溶液，在一定程度上影響了飲水的適口性。因此，為了保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)采用口腔灌服的方式給藥。

組別ALT(IU/L)T-Bili(μmol/L)CREA(μmol/L)BUN(mmol/L)空白對(duì)照組4.20±0.7910.31±0.6537.20±1.480.69±0.04桉薄溶液低劑量組4.70±0.6410.74±0.5538.30±1.490.68±0.06桉薄溶液中劑量組4.90±0.8610.59±0.3838.40±1.580.65±0.05桉薄溶液高劑量組8.70±1.25a20.37±1.51a44.00±1.49a0.46±0.10a

注：a表示與空白對(duì)照組比較，高劑量組4項(xiàng)指標(biāo)差異性極顯著(P<0.01)

組別ALT(IU/L)T-Bili(μmol/L)CREA(μmol/L)BUN(mmol/L)空白對(duì)照組4.50±0.7110.33±0.7137.40±0.970.70±0.04桉薄溶液低劑量組4.60±0.7010.60±0.2638.00±1.050.69±0.04桉薄溶液中劑量組4.50±0.5310.43±0.5437.80±1.320.69±0.02桉薄溶液高劑量組5.00±0.6710.75±0.4938.30±1.160.72±0.03

注：與空白對(duì)照組比較，各組雞的4項(xiàng)指標(biāo)均無(wú)顯著差異(P>0.05)

4.2 臨床表現(xiàn) 雞連續(xù)5 d灌服有效劑量1倍、3倍和5倍的桉薄溶液，各組雞的臨床表現(xiàn)均未出現(xiàn)任何異常，表明桉薄溶液分別按高、中、低3個(gè)濃度給藥，對(duì)試驗(yàn)雞的臨床表現(xiàn)無(wú)明顯影響。

4.3 生長(zhǎng)水平

4.3.1 飲水量 從日平均飲水量中看出，給藥5 d內(nèi)，各組雞每日的平均飲水量均無(wú)顯著差異(P>0.05)，結(jié)果表明，桉薄溶液分別按高、中、低3個(gè)濃度給藥，對(duì)試驗(yàn)雞的飲水無(wú)明顯影響。

4.3.2 體重與料肉比 由體重結(jié)果可以看出，與空白組對(duì)比，給藥各組雞在12日齡和17日齡的體重均無(wú)顯著差異(P>0.05)，12日齡料肉比無(wú)顯著差異(P>0.05)，結(jié)果表明，桉薄溶液分別按高、中、低3個(gè)濃度給藥，對(duì)靶動(dòng)物(雞)的體重和料肉比均無(wú)顯著影響。

4.4 生化指標(biāo)

4.4.1 生化指標(biāo)的選擇 本試驗(yàn)未對(duì)靶動(dòng)物(雞)進(jìn)行血液學(xué)檢測(cè)，原因是由于禽用血常規(guī)測(cè)定儀不普遍，且全血保存時(shí)間較短，該項(xiàng)檢測(cè)存在一定難度。因此，本試驗(yàn)未對(duì)靶動(dòng)物(雞)進(jìn)行血液學(xué)檢測(cè)，直接選擇檢測(cè)靶動(dòng)物(雞)的血生化指標(biāo)。

本試驗(yàn)主要通過(guò)測(cè)定雞血清中的谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽紅素(T-Bili)、肌酐(CREA)和尿素氮(BUN)四項(xiàng)指標(biāo)來(lái)反映藥物對(duì)靶動(dòng)物(雞)的主要臟器(包括肝臟和腎臟等)有無(wú)損害。

4.4.2 生化指標(biāo)分析 通過(guò)對(duì)各組雞進(jìn)行血生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)(見表4和表5)：(1)12日齡時(shí)，中、低劑量組的4個(gè)血生化指標(biāo)(ALT、T-Bili、CREA、BUN)與空白對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)；而高劑量組ALT、T-Bili和CREA指標(biāo)均高于空白對(duì)照組，BUN指標(biāo)低于空白對(duì)照組，且差異極顯著(P<0.01)。醫(yī)學(xué)臨床中[2-4]，谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性增高常見于肝膽疾病，如藥物引起的中毒性肝炎等；總膽紅素指標(biāo)也是重要的常規(guī)肝功能指標(biāo)，其活性增高亦代表肝臟出現(xiàn)一定的損害；肌酐檢測(cè)是臨床反應(yīng)腎小球?yàn)V過(guò)率的較好指標(biāo)，其活性增高常見于急性腎小球腎炎和腎功能不全等；尿素氮是蛋白質(zhì)分解代謝的終產(chǎn)物，在肝中合成，由血液運(yùn)輸?shù)侥I隨尿排泄，血尿素濃度增高常見于腎功能不全等，但血尿素氮濃度降低無(wú)臨床病理性表達(dá)的意義[5]。由檢測(cè)結(jié)果可以看出，桉薄溶液連續(xù)給藥5 d，高劑量組試驗(yàn)雞的谷丙轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)顯著高于空白對(duì)照組，表明高劑量組雞的肝臟可能受到了一定程度的損害，但由于臨床癥狀表現(xiàn)不明顯，因此給藥后繼續(xù)觀察。(2)17日齡，再次檢測(cè)各組的血生化指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，高、中、低劑量組的四個(gè)血生化指標(biāo)(ALT、T-Bili、CREA、BUN)與空白對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明，高劑量組連續(xù)給藥5 d可能引起雞的肝臟出現(xiàn)一定損害，導(dǎo)致血生化指標(biāo)異常，但停止給藥后各項(xiàng)指標(biāo)均可恢復(fù)正常。

綜上所述，給雞連續(xù)5 d灌服有效劑量1倍和3倍的桉薄溶液，對(duì)雞的臨床癥狀、生長(zhǎng)水平和血生化指標(biāo)均無(wú)明顯影響；而有效劑量5倍的桉薄溶液對(duì)雞的血生化指標(biāo)有一定影響，但停止給藥后可自行恢復(fù)。