天然止咳化痰乳劑對(duì)人工誘導(dǎo)兔子病理模型抗損傷的觀察

徐光科，左春生，吳海港

(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院,河南 信陽(yáng) 464000)

環(huán)境中有害氣體如氨氣進(jìn)入呼吸道后被吸收，引起支氣管或細(xì)支氣管周?chē)?xì)胞損傷，肺功能下降。此外，在有害氣體刺激下肺泡巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增多，分泌腫瘤壞死因子-α、干擾素、IL-1等炎性介質(zhì)，啟動(dòng)早期炎癥反應(yīng)并維持炎癥反應(yīng)，對(duì)肺血管以及肺組織造成長(zhǎng)期的慢性炎癥刺激[1-2]。炎癥反應(yīng)的基礎(chǔ)是肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。自然情況下，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)肺毛細(xì)血管血管及肺組織起保護(hù)作用。氨氣長(zhǎng)期刺激的情況下，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞受損，炎癥反應(yīng)就會(huì)產(chǎn)生，嗜中性粒細(xì)胞是最早出現(xiàn)在炎癥部位的細(xì)胞。當(dāng)肺組織受損時(shí)，肺組織中浸潤(rùn)嗜中性粒細(xì)胞，它會(huì)釋放炎癥介質(zhì)、蛋白酶、氧自由基[3]，進(jìn)而再損傷肺組織

止咳化痰乳劑是一種純天然副作用小的中藥，主要成分包括紫蘇，陳皮和桉葉。紫蘇中含有多種植物多酚類(lèi)物質(zhì)和黃酮類(lèi)物質(zhì)。這些物質(zhì)大多有酚羥基，而酚羥基能夠清除活性氧和自由基[4]。紫蘇中的植物多酚類(lèi)具有較強(qiáng)的抗氧化能力，包括迷迭香酸、咖啡酸乙烯酯、咖啡酸烯萜酯等。紫蘇提取物中迷迭香酸具有清除羥自由基的作用[5]。此外，紫蘇提取物具有鎮(zhèn)咳作用，用紫蘇種子脂肪油以2.5 g/kg·bw劑量灌服小鼠，小鼠咳嗽次數(shù)明顯減少并且咳嗽間隔時(shí)間變長(zhǎng)。

陳皮中的黃酮類(lèi)化合物主要有黃酮、黃酮醇等，其以糖苷的形式存在于陳皮素、橙皮苷等物質(zhì)中。川陳皮素能抑制自由基和羥自由基的產(chǎn)生，減少某些細(xì)胞中活性氧的產(chǎn)生，從而起抗氧化作用。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，陳皮水提液能抑制動(dòng)物心、肝組織的脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，還可以增強(qiáng)SOD酶活性[6-7]。

桉葉是常用的中草藥，有祛痰、抗菌、消炎鎮(zhèn)痛等作用。藥理試驗(yàn)表明，桉葉油能促進(jìn)唾液分泌，隨即激活吞咽反射，抑制隨即發(fā)生的咳嗽[8]，因而可作為氣體吸入劑用于呼吸道疾病的治療。鞣質(zhì)、黃酮類(lèi)和萜類(lèi)是桉葉非油成分中主要的抗氧化物質(zhì)。國(guó)外學(xué)者研究了19種桉屬植物并分離到9種活性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)具有沒(méi)食子?；镊焚|(zhì)和?；S酮醇類(lèi)化合物抗氧化活性很強(qiáng)[9]。

本試驗(yàn)率先使用氨氣刺激家兔初步探索構(gòu)建肺損傷模型，并用止咳化痰乳劑治療并評(píng)估藥物抗病理?yè)p傷的療效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康家兔，雌雄各半，體重約2 kg，購(gòu)自信陽(yáng)職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 試劑與藥品 氨水、甲醛、二甲苯、無(wú)水乙醇，均購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)試劑公司；止咳化痰乳劑(信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院獸藥實(shí)驗(yàn)室自制)。

1.3 儀器 BS-490生化分析儀，BC-2800 Ve.t.獸用血細(xì)胞分析儀，邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；QPJ-1B病理石蠟切片機(jī)，上海斯歐醫(yī)療器械有限公司；NE-C25S霧化器，歐姆龍(大連)有限公司；BW GAXT-A 氨氣檢測(cè)儀，加拿大BW科技有限公司。

1.4 方法 自制3個(gè)容器，分別標(biāo)記為甲箱、乙箱、丙箱。本試驗(yàn)采用一個(gè)長(zhǎng)150 cm，寬100 cm，高80 cm的塑料密閉容器，上邊側(cè)面開(kāi)數(shù)個(gè)小孔以保證箱內(nèi)為常壓狀態(tài)及箱內(nèi)外溫濕度一致。

將健康家兔，隨機(jī)分為A、B、C 3組，每組5只，A組為正常對(duì)照組，B組為模型組，C組為治療組。A組放入甲箱，不用氨氣刺激，連續(xù)飼養(yǎng)10 d。B組放入乙箱用7.8%氨水噴霧刺激，1次2 h，1日2次，兩次刺激間隔3 h，連續(xù)刺激9 d，建立肺損傷模型。C組放入丙箱用相同濃度氨水刺激相同時(shí)間，每次開(kāi)始試驗(yàn)前1 h以0.5 mL/只的劑量灌服止咳化痰藥，其余條件3組都一樣。(箱內(nèi)氨氣濃度用氨氣測(cè)定儀測(cè)定濃度為：97 mg/m3)

整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中兔子自由呼吸，自由采食，自由飲水，無(wú)窒息現(xiàn)象。在氨氣刺激期及正常飼養(yǎng)時(shí)觀察兔子活動(dòng)行為與精神狀態(tài)等一般形態(tài)，同時(shí)監(jiān)測(cè)兔子的體溫以及刺激前后呼吸頻率變化的平均值。

在試驗(yàn)期間采全血進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)和血常規(guī)檢測(cè)以摸索建立肺損傷模型合適的條件。氨氣刺激結(jié)束后，將A、B、C 3組家兔致死，手術(shù)切除全肺，0.9%生理鹽水清洗表面血污等，然后用10%福爾馬林溶液固定24 h，制作病理切片H.E.染色。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)家兔一般行為及呼吸的影響 在刺激10 min左右，兔子出現(xiàn)特別煩躁不安的現(xiàn)象，之后慢慢轉(zhuǎn)為安靜狀態(tài)；整個(gè)過(guò)程中，兔子有眨眼甚至閉眼、流眼淚、扒鼻，并伴有噴嚏、間歇性咳嗽現(xiàn)象；刺激結(jié)束后，動(dòng)物飲水、飲食并無(wú)明顯改變，5 min后精神狀態(tài)恢復(fù)原狀。試驗(yàn)整個(gè)過(guò)程中家兔體溫正常，A組呼吸頻率36-45 times/min；B組呼吸頻率48-67 times/min；C組呼吸頻率42-55 times/min

2.2 血液生理指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果 家兔血液生理指標(biāo)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1，從表中可以看出模型組兔子白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞隨著氨氣刺激時(shí)間的增加，呈增高趨勢(shì)，比對(duì)照組分別提高58.7%、71.7%、50.1%、 116.7%，差異顯著(P<0.05)；而治療組和模型組相比，白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著下降，分別降低31.%、36.7%、50.1%、29.2%，差異顯著(P<0.05)提示止咳化痰乳劑可以降低肺臟炎癥反應(yīng)；治療組和對(duì)照組相比白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞變化不大，差異不顯著。嗜中性粒細(xì)胞差異顯著；試驗(yàn)各組紅細(xì)胞、血小板、血紅蛋白差異不顯著。

表1 各組家兔血液生理指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

注：同行不同字母表示差異顯著(P﹤0.05)，相同字母表示差異不顯著(P﹥0.05)，下表同

2.3 血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 家兔血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。對(duì)照組相比，模型組中家兔的ALT、BUN、 血氨分別提高106.5%、91.6%、320%，差異顯著(P<0.05)。提示：經(jīng)藥物治療后，治療組中ALT、BUN、 血氨較模型組分別降低：34.7%、17.39%、31.3%，差異顯著，提示止咳化痰乳劑可以減少氨氣對(duì)肝臟和腎臟的功能損傷。試驗(yàn)各組ALKP、 CREA、GLU、TP 變化不大。差異不顯著。

表2 各組家兔血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.4 病理學(xué)診斷結(jié)果 正常組家兔肺泡結(jié)構(gòu)完整清晰，肺泡隔無(wú)腫脹，腔內(nèi)無(wú)滲出物。與治療組(見(jiàn)中插彩版圖1)對(duì)比，模型組(見(jiàn)中插彩版圖2)明顯可見(jiàn)肺間質(zhì)充血、出血，腔內(nèi)有紅細(xì)胞滲出，肺間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡大小不一，部分肺泡腔變小且肺泡壁變厚甚至實(shí)變。治療組雖有炎癥細(xì)胞增生，但不明顯，肺泡腔內(nèi)無(wú)滲出物。肺泡壁雖有增厚，但基本結(jié)構(gòu)完整，從整體上看治療組的肺損傷有明顯好轉(zhuǎn)。

3 討論

畜舍內(nèi)，家畜排泄物和飼料等有機(jī)物的分解，可產(chǎn)生許多化學(xué)物質(zhì)。其中會(huì)出現(xiàn)許多有害成分，危害最大的主要有：氨、硫化氫等。在畜舍內(nèi)，氨大多由含氮有機(jī)物(糞、尿、飼料和墊草等)分解而來(lái)。畜舍空氣中一定濃度的氨將影響動(dòng)物的呼吸道疾病，當(dāng)空氣中氨的濃度達(dá)到50～75 mg/m3，對(duì)仔豬抗肺部疾病能力產(chǎn)生不良影響。本試驗(yàn)采用氨氣刺激法構(gòu)建肺損傷模型，初步探索得出97 mg/m3的氨氣濃度可用于構(gòu)建肺損傷模型。

氨氣刺激前后兔子呼吸加快可能的原因?yàn)椋杭彝梦氚睔?，氨氣可能刺激呼吸道黏膜?xì)胞并且損傷肺血管內(nèi)皮細(xì)胞[10]，引起炎癥反應(yīng)，在炎性介質(zhì)的參與下，肺微毛細(xì)血管損傷進(jìn)而導(dǎo)致肺水腫。同時(shí)，氨氣吸入的早期，家兔體內(nèi)氧自由基增多，氧自由基會(huì)對(duì)肺細(xì)胞生物膜和肺間質(zhì)造成破壞，影響肺微血管的結(jié)構(gòu)和功能，降低肺的抗炎和抗氧化能力，對(duì)肺組織造成損傷使呼吸功能出現(xiàn)障礙。

生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組比治療組的ALT升高較多，提示氨氣可能對(duì)肝細(xì)胞造成損傷；BUN升高和CREA處于正常波動(dòng)范圍，可能氨氣的吸入對(duì)腎臟損傷不及肝臟敏感；進(jìn)入肺泡的氨，大部分被吸收至血液，結(jié)果顯示，血氨持續(xù)升高，提示肝細(xì)胞可能受損。若加大氨水濃度或增加刺激時(shí)間，肝臟可能出現(xiàn)代謝異常甚至出現(xiàn)嚴(yán)重病變；經(jīng)藥物治療后，治療組中ALT、BUN、 血氨較模型組分別降低：34.7%、17.39%、31.3%，提示止咳化痰乳劑可以減少氨氣對(duì)肝臟和腎臟的功能損傷。

肺組織病理學(xué)診斷結(jié)果為，正常組的兔子未見(jiàn)病理?yè)p傷，肺泡結(jié)構(gòu)完整。模型組的兔子明顯可見(jiàn)肺間質(zhì)有大量紅細(xì)胞、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡腔大小不一，腔內(nèi)有少量紅細(xì)胞滲出，部分肺泡腔變小且肺泡壁變厚甚至實(shí)變。血常規(guī)檢測(cè)顯示，模型組兔子氨氣刺激后白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞呈增高趨勢(shì)，比對(duì)照組分別提高58.7%、71.7%、50.1%、 116.7%，結(jié)合病理切片觀測(cè)提示，肺經(jīng)過(guò)氨氣刺激后炎癥損傷比較明顯。

治療組顯示，炎癥明顯好轉(zhuǎn)，肺間質(zhì)有少量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，出血不明顯，肺泡腔內(nèi)無(wú)滲出物，肺泡隔結(jié)構(gòu)較完整。血常規(guī)檢測(cè)顯示，而治療組和模型組相比，白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著下降，分別降低31.%、36.7%、50.1%、29.2%。說(shuō)明紫蘇、陳皮、桉葉等中藥對(duì)抑制炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)，清除體內(nèi)氧自由基以及對(duì)氨氣引起的肺部炎癥損傷有保護(hù)作用。

本試驗(yàn)所用止咳化痰乳劑富含桉葉素、α-蒎烯、紫蘇醛，其機(jī)理可能是：紫蘇乙醇提取物可通過(guò)調(diào)節(jié) Src-家族 酪氨酸激酶信號(hào)傳導(dǎo)通路并減少 Ca升動(dòng)員，調(diào)節(jié) N-甲酰L-甲硫氨酰L-白氨酰-L苯丙氨酸刺激的嗜中性粒細(xì)胞的激活[11]；降低慢性支 氣管炎大鼠的內(nèi)皮素-1、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量，提高超氧化物歧化酶 (Superoxidedismutase，SOD)活性和 NO含量，清除機(jī)體自由基，提高機(jī)體抗氧化損傷能力，減輕氣道炎癥反應(yīng)[12,13]；桉葉素、α-蒎烯可能通過(guò)抑制TLR4/MyD88通路及NLRP3炎癥小體活化減少I(mǎi)L-1β表達(dá)并抑制Th免疫反應(yīng)從而減輕了氨氣所致的急性肺炎[14]。

綜上所述，天然獸用止咳化痰乳劑對(duì)肺損傷有保護(hù)作用，為減少抗生素的使用及推廣天然止咳化痰乳劑提供理論依據(jù)，同時(shí)也為治療呼吸系統(tǒng)疾病提供了新途徑。