大鯢脾臟結(jié)節(jié)病的防治試驗(yàn)

王 強(qiáng)，程 潔，梁 毅，羅 強(qiáng)，王朝明，黃 利，吳 青

(1.重慶市壁山區(qū)養(yǎng)殖業(yè)技術(shù)服務(wù)中心，重慶 壁山 402760；2.西南大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，重慶 榮昌 402460)

大鯢，俗名“娃娃魚”，是世界上現(xiàn)存最大的兩棲動(dòng)物，屬于兩棲綱有尾目隱鰓鯢科。是國家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物，是國家特色農(nóng)業(yè)重點(diǎn)開發(fā)生態(tài)養(yǎng)殖品種。具有可食用、 藥用 、觀賞 、科研等經(jīng)濟(jì)價(jià)值。近年來，隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的興起與發(fā)展，大鯢的人工養(yǎng)殖已成為具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值的產(chǎn)業(yè)，但是，各種養(yǎng)殖病害問題也隨之而來，成為制約大鯢養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展的重要原因之一,給養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

中藥是指在中國物性理論 (陰陽五行學(xué)說)指導(dǎo)下用于防治人和動(dòng)物疾病、促進(jìn)健康、 提高生產(chǎn)性能和動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量的天然物質(zhì)，我國擁有豐富的中藥資源，在漁業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐使用上，中藥有著悠久的使用歷史。研究顯示，中藥有著多方面的免疫活性物質(zhì)，能影響和調(diào)節(jié)動(dòng)物體免疫功能，提高水產(chǎn)動(dòng)物的抗病力[1]，減少魚體感染疾病的幾率。使用中藥于水產(chǎn)養(yǎng)殖防治魚病不僅解決了化學(xué)藥物的殘留和產(chǎn)生抗藥性等問題，而且對于發(fā)展綠色養(yǎng)殖，生產(chǎn)綠色無公害水產(chǎn)品，提高養(yǎng)殖生產(chǎn)效益等方面有著顯著的效果。

2008年4月，重慶開縣的某個(gè)大鯢養(yǎng)殖場出現(xiàn)了體表出現(xiàn)大量血點(diǎn)及出血現(xiàn)象，在身體腹部，兩側(cè)和尾部較明顯，身體體表分泌大量白色黏液，病程較長的伴有四肢端部潰爛，大鯢不吃食。剖檢觀察其脾臟出現(xiàn)大量白色結(jié)節(jié)，并常伴有瘀血斑和壞死病灶，有的胃、腸道脹氣，腸壁充血潰爛，有的伴有紅色或乳白色的腹水，有的心臟瘀血肝臟有的出現(xiàn)瘀血、變性和壞死，有的肺出現(xiàn)發(fā)黑變性病灶，有的直腸末端出現(xiàn)發(fā)黑變性病灶(見中插彩版圖1)。其后在四川一些養(yǎng)殖場也陸續(xù)出現(xiàn)此病。目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道。查閱了有關(guān)的文獻(xiàn)，根據(jù)其作用機(jī)理，篩選了幾種中藥，通過采取中西結(jié)合的防治措施，大鯢的體質(zhì)有所增強(qiáng)，病情得到了有效的控制。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥配方：大青葉，連翹，穿心蓮，黃芪，大黃，黃連，杜仲粉，金銀花，脯骨脂，黨參，板藍(lán)根。

試驗(yàn)試劑：姬姆薩染液 酸性磷酸酶測定試劑盒，一氧化氮和酶測定試劑盒，氯化鈉溶液，枸櫞酸鈉溶液。

試劑配制：紅細(xì)胞稀釋液：氯化鈉0.6 g，加蒸餾水100 mL溶解，4 ℃保存至錐形瓶中備用。

白細(xì)胞稀釋液：枸櫞酸鈉3 g，加中性甲醛 1 mL，蒸餾水定容至100 mL，4 ℃保存至錐形瓶中備用。

1%肝素鈉：肝素鈉1 g，加0.6%生理鹽水100 mL，漩渦震蕩使之溶解，4 ℃保存至錐形瓶中備用。

實(shí)驗(yàn)設(shè)備：冰箱 恒溫水浴鍋，小型離心機(jī)，顯微鏡，分光光度計(jì)，全自動(dòng)生化分析儀。

1.2 試驗(yàn)方法 試驗(yàn)前對所有試驗(yàn)池、工具，用高錳酸鉀進(jìn)行消毒處理。根據(jù)養(yǎng)殖條件，選擇4個(gè)養(yǎng)殖池，以每2個(gè)池分為1組，2組，然后進(jìn)行編號(hào)，其中1號(hào)為對照組，其余為試驗(yàn)組，對隨機(jī)選取患病大鯢80尾，計(jì)量體重，隨機(jī)分配至4個(gè)養(yǎng)殖池中，記錄娃娃魚患病特征，飼養(yǎng)環(huán)境保持一致。根據(jù)該養(yǎng)殖場的養(yǎng)殖管理習(xí)慣以及大鯢的攝食習(xí)慣，試驗(yàn)組的大鯢取用熬制好的濃縮中藥湯劑對患病大鯢進(jìn)行灌服操作，每日用量(0.8 mL/kg·bw),1次/d；本試驗(yàn)采用自身對照，故不設(shè)對照組。灌藥后對病鯢的恢復(fù)情況進(jìn)行記錄，每15天拍照1次，選出有代表性的進(jìn)行比較。

1個(gè)療程后，兩人配合進(jìn)行，隨機(jī)對每個(gè)魚池挑選1條進(jìn)行采血，采取的血液放入加了肝素鈉的EP管中4 ℃保存。

將放置在冰箱中保存的EP管取出，靜置1 min，然后在3 000 r/min離心10 min，取上層液使用，剩余液體放入冰箱保存?zhèn)溆?。按試劑盒說明書進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血清中的酸性磷酸酶(ACP)以及一氧化氮合酶(NOS)的測定、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)的測定。

1. 3 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)中的ANOVA軟件進(jìn)行方差分析和均值多重比較法處理，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性水平為P<0.05，極顯著水平為P<0.01。

2 結(jié)果

2.1 灌藥前后大鯢的恢復(fù)情況對比 灌藥前，大鯢體表背部出現(xiàn)潰爛，四肢、尾部發(fā)生腫大、潰爛甚至出現(xiàn)穿孔現(xiàn)象，灌藥后大鯢背部、四肢及尾部的潰爛面逐漸縮小，患病大鯢體表不再出現(xiàn)紅腫、潰爛等情況，身體腹部及背部的潰爛情況有明顯的好轉(zhuǎn)，但是有極個(gè)別的恢復(fù)情況不是太明顯，綜合死亡的個(gè)數(shù)逐漸降低，病情得到了相對有效的控制，治愈率達(dá)到82.8%。

2. 2 患病大鯢灌藥前后的血液生理指標(biāo)的比較分析

2. 2.1 血細(xì)胞計(jì)數(shù) 通過顯微觀察大鯢血涂片，對血液細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，其結(jié)果見表1 。由方差分析得出，與灌藥后比較，患病大鯢灌藥前的白細(xì)胞數(shù)目顯著性高于灌藥后(P<0.05),紅細(xì)胞數(shù)目差異不顯著(P>0.05)。

表1 患病大鯢灌服中藥前后血細(xì)胞數(shù)量變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

2.2.2 白細(xì)胞分類計(jì)數(shù) 通過對血涂片的觀察，白細(xì)胞的分類比例如表2所示。方差分析表明，相比較灌藥前，患病大鯢的嗜中性粒細(xì)胞比例顯著下降(P<0.05)，淋巴細(xì)胞比例顯著上升(P<0.05)，嗜酸性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞，單核細(xì)胞變化比例不顯著(P>0.05)

表2 患病大鯢灌服中藥前后白細(xì)胞分類比例變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

2.2.3 患病大鯢灌藥前后生化指標(biāo)的比較 通過開縣博愛醫(yī)院對大鯢血清的谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢驗(yàn)報(bào)告單進(jìn)行分析，結(jié)果如表3所示。由方差分析顯示，相對于灌藥前，患病大鯢在灌藥后血清指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶活性顯著性下降(P<0.05)。

通過用一氧化氮合酶(NOS),酸性磷酸酶(ACP)試劑盒對患病大鯢血清酶的檢測，所得結(jié)果如下表。相比較灌藥前，灌藥后患病大鯢的一氧化氮合酶及酸性磷酸酶活性顯著下降(P<0.05)。

表3 患病大鯢灌服中藥前后生化指標(biāo)變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)

3 討論

3.1 結(jié)節(jié)病致病菌對于大鯢的各項(xiàng)生理指標(biāo)的影響 紅細(xì)胞是血液中最多的一類血細(xì)胞，主要功能是運(yùn)輸氧氣和代謝二氧化碳，使機(jī)體生命活動(dòng)正常。魚類的紅細(xì)胞數(shù)在一定程度上能反映魚體的健康狀況[2]。目前，關(guān)于水生動(dòng)物患病后的血液紅細(xì)胞數(shù)目變化的研究，數(shù)據(jù)各有不同?；疾【C合征的石斑魚的血液紅細(xì)胞數(shù)相對于正常魚高23.79%[3]。感染嗜水汽單胞菌的香魚血液紅細(xì)胞數(shù)目顯著降低[4]。本試驗(yàn)中，中藥灌服患病大鯢前后，血液紅細(xì)胞數(shù)目變化不顯著(P>0.05)，表明結(jié)節(jié)病致病菌對大鯢的紅細(xì)胞數(shù)目變化差異不顯著(P>0.05)。

白細(xì)胞具有免疫防御功能，它通過吞噬細(xì)胞吞噬有害物質(zhì)以及淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗體來免疫調(diào)節(jié)機(jī)體。一般來說，魚在發(fā)病后，其血液中的白細(xì)胞數(shù)目會(huì)上升?；技∪鉂€病的中華倒刺鲃[5]的白細(xì)胞數(shù)目顯著性上升，當(dāng)疾病較為嚴(yán)重時(shí)，魚體的造血功能和免疫功能損傷嚴(yán)重，則變?yōu)榘准?xì)胞數(shù)目下降。患溶藻弧菌的鱸魚[6]病發(fā)后期，白細(xì)胞數(shù)目下降。本試驗(yàn)中，大鯢患脾臟結(jié)節(jié)病后，血液生理生化指標(biāo)表現(xiàn)為嗜中性粒細(xì)胞比例顯著性上升(P<0.05)，表明大鯢的細(xì)胞吞噬能力較強(qiáng)，淋巴細(xì)胞比例顯著性下降(P<0.05)，機(jī)體免疫能力較弱，單核細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，嗜堿性粒細(xì)胞比例變化不大。

正常情況下血液中谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性低且較為穩(wěn)定。當(dāng)機(jī)體患病導(dǎo)致肝臟細(xì)胞受損時(shí)[7]，該類酶被釋放到血清中，導(dǎo)致這兩種酶的活性在組織中降低而在血液中升高?；既茉寤【〉幕|[6]血清中AST、ALT的含量上升，認(rèn)為是肝臟組織受損，致使血液中血清酶的含量上升。本試驗(yàn)中，大鯢患結(jié)節(jié)病后血清中ALT、AST含量顯著上升，表明大鯢在結(jié)節(jié)病致病菌的作用下，肝臟組織受到損傷。

酸性磷酸酶(ACP)、一氧化氮合酶(NOS)是存在于血液中參與非特異性的免疫相關(guān)酶[2]，在機(jī)體的免疫防御過程中起了十分重要的作用。研究表明，一氧化氮參與機(jī)體的免疫，能夠殺滅細(xì)菌和病毒。大鯢在患病后血液中一氧化氮合酶的活性顯著性升高。酸性磷酸酶(ACP)能促進(jìn)病原物質(zhì)在溶酶體內(nèi)的消化降解。日本鰻鱺感染嗜水氣單胞菌后，通過提高血清中ACP活力達(dá)到快速殺菌的目的。本試驗(yàn)中，大鯢患結(jié)節(jié)病后，ACP的活性升高。

3.2 中藥對于患結(jié)節(jié)病的大鯢的影響 比較灌藥前后的大鯢的血液生理生化指標(biāo)。相對于灌藥前，灌藥后的病鯢的血清中嗜中性粒細(xì)胞比例顯著性下降，淋巴細(xì)胞比例顯著性的上升，表明大鯢在灌藥后，以嗜中性粒細(xì)胞為主要非特異性免疫防御功能減弱。以淋巴細(xì)胞為主的免疫功能逐漸恢復(fù)。此外，患病大鯢血液中的谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶的活性相對于灌藥前，顯著性下降(P<0.05)，表明肝臟的受損程度在灌藥后逐漸減小，其功能得到了恢復(fù)。另外，灌藥后，患病大鯢的NOS、ACP活性顯著性下降，表明以吞噬細(xì)胞為 主的非特異性免疫應(yīng)答激活程度逐漸降低，大鯢魚體免疫能力有所提高，大鯢病情得到了有效控制。表明本研究所篩選的幾種中藥在一定程度上對大鯢的病情有一定的抑制作用。