大同黃花菜組織培養(yǎng)試驗(yàn)初報(bào)

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(1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，設(shè)施農(nóng)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心， 山西 大同 037009；2.山西大同大學(xué)， 山西 大同 037009)

黃花菜(HemerocallisflavaL.)又名金針菜，為百合科萱草屬多年生草本植物，原產(chǎn)于亞洲和歐洲的溫帶地區(qū)[1]。黃花菜既是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的植物性食品，也可作為園林觀賞花卉，還是優(yōu)良的水土保持植物[2-3]。由于對(duì)環(huán)境條件的適應(yīng)性強(qiáng)、栽培技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單，在我國(guó)各地均有栽培，加上經(jīng)濟(jì)效益較好，近年來(lái)種植面積還在不斷擴(kuò)大[4]。我國(guó)黃花菜品種很多，其中大同黃花菜因顏色鮮黃、蕾長(zhǎng)肉厚、脆嫩爽口、營(yíng)養(yǎng)豐富，廣受消費(fèi)者的青睞，是大同地區(qū)的特色產(chǎn)業(yè)和山西省名優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品，為當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)業(yè)增收、農(nóng)民致富和種植結(jié)構(gòu)調(diào)整做出了重要貢獻(xiàn)[5-6]。但是大同黃花菜在生產(chǎn)中存在品種單一、繁殖速度慢、種植規(guī)模較小等問(wèn)題，導(dǎo)致其在國(guó)內(nèi)六大黃花菜產(chǎn)區(qū)中知名度和市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力都較差。目前，黃花菜種苗的繁殖主要采取傳統(tǒng)的分株、播種、切根分芽、花莛扦插等方法[7-9]。這些方法由于受到母株自身生長(zhǎng)年限、生長(zhǎng)環(huán)境條件及當(dāng)?shù)貧夂虻闹萍s，繁殖系數(shù)低、周期長(zhǎng)，影響了種苗的更新?lián)Q代和植株的生長(zhǎng)發(fā)育。

與傳統(tǒng)的繁殖方式相比，植物組織培養(yǎng)不僅極大地縮短了成苗時(shí)間，增加了繁殖系數(shù)，且有利于保持品種的優(yōu)良性狀，能夠?qū)崿F(xiàn)種苗的快速繁殖、品種提純，甚至工廠化生產(chǎn)[10]。一些學(xué)者以幼葉、根狀莖、花器官等部位為外植體，在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)黃花菜的組織培養(yǎng)進(jìn)行了研究[11-15]，為利用組織培養(yǎng)技術(shù)開(kāi)展黃花菜的快速繁殖提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)和方法。但是，國(guó)內(nèi)黃花菜各大產(chǎn)區(qū)仍然是以傳統(tǒng)的繁殖方法為主，尚未見(jiàn)到生產(chǎn)上應(yīng)用組織培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行快速繁殖的報(bào)道，說(shuō)明黃花菜的組織培養(yǎng)技術(shù)和體系尚不成熟。為此，本試驗(yàn)以種子的胚芽端為外植體，初步研究了大同黃花菜組織培養(yǎng)的效果，為下一步建立黃花菜不同外植體的組織培養(yǎng)體系奠定基礎(chǔ)，為今后大同黃花菜的快速繁殖和工廠化育苗提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2017年9—11月在山西大同大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心進(jìn)行，供試黃花菜種子采自山西大同大學(xué)生命科學(xué)實(shí)驗(yàn)基地，品種為大同黃花菜。供試植物激素包括生長(zhǎng)素類(lèi)的NAA、細(xì)胞分裂素類(lèi)的6-BA和IBA。

1.2 培養(yǎng)基

本研究使用的幾種培養(yǎng)基成分見(jiàn)表1。

表1 各階段所用培養(yǎng)基的成分

培養(yǎng)基種類(lèi)基本成分附加成分(mg/L)6-BAIBANAA種子培養(yǎng)基MS000誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)基MS2.000.1生根培養(yǎng)基1/2MS01.00.2

1.3 試驗(yàn)方法

黃花菜種子在(25±2)℃下用無(wú)菌水浸泡24 h，取出后在超凈工作臺(tái)上用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中用無(wú)菌鑷子小心剝?nèi)シN皮。而后用75%酒精浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗3次后用0.1%升汞浸泡10 min，再用無(wú)菌水沖洗5次后用無(wú)菌濾紙吸干水分。然后用無(wú)菌刀片將種子橫切成兩半，比例為胚芽端∶無(wú)胚端=1∶2，種子胚芽端用于培養(yǎng)愈傷組織[16]。將種子胚芽端在75%酒精中浸泡15 s后用無(wú)菌水沖洗3次，最后用無(wú)菌濾紙吸干表面水分，即可用于接種。

注：A為材料的胚軸突出；B為突出部分發(fā)育為淡黃色的芽；C為芽從淡黃色變?yōu)榫G色；D為芽開(kāi)始抽葉；E為葉片生長(zhǎng)旺盛；F為誘導(dǎo)生根；G為根的繼代生長(zhǎng)。圖1 黃花菜種子組織培養(yǎng)不經(jīng)愈傷組織直接發(fā)育為芽的各階段生長(zhǎng)情況

將準(zhǔn)備好的胚芽端材料接種在種子培養(yǎng)基上，約經(jīng)5 d后胚軸從切口處突出形成淡黃色的芽，即可轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。再經(jīng)3～5 d后誘導(dǎo)出的芽由淡黃色逐漸變綠，隨后再經(jīng)2 d左右開(kāi)始抽葉，此時(shí)轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上。第2片葉子生長(zhǎng)至長(zhǎng)2～3 cm時(shí)，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上。每個(gè)階段每瓶培養(yǎng)基接種4個(gè)材料，每次接種完后立即置于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，同時(shí)觀察并記錄愈傷組織形成、芽分化、葉抽生、根誘導(dǎo)等生長(zhǎng)變化情況。定期用75%酒精擦洗滅菌，保持培養(yǎng)溫度(25±2)℃，光照強(qiáng)度1 000～1 500 lx，光照時(shí)間10 h/d[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)

黃花菜種子的胚芽端在種子培養(yǎng)基上培養(yǎng)約3 d后切口處有乳白色的胚軸向外突出，突出率為87.50%。發(fā)生胚軸突出的胚芽端材料繼續(xù)培養(yǎng)2 d后出現(xiàn)2種情況：約42.86%的材料突出部分不經(jīng)愈傷組織直接發(fā)育成為淡黃色的芽(圖1-B)；其余57.14%的材料再培養(yǎng)2 d突出部分逐漸變綠，隨后形成愈傷組織(圖2-B)。

2.2 芽的分化

發(fā)生胚軸突出的材料接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，發(fā)育為淡黃色芽的材料再培養(yǎng)3～5 d后誘導(dǎo)出的芽由淡黃色逐漸變綠，2 d后陸續(xù)開(kāi)始抽葉，抽葉率為100%(圖1-C、圖1-D)。突出部分形成愈傷組織的材料不能分化出芽，在繼代培養(yǎng)基上仍然保持愈傷組織狀態(tài)(圖2-C)。

2.3 繼代培養(yǎng)

剛抽葉的材料轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上葉片不斷伸長(zhǎng)，第1片葉子長(zhǎng)約2 cm后又抽出第2片葉子，抽葉率100%。第2片葉子長(zhǎng)勢(shì)比較旺盛，經(jīng)過(guò)2次繼代培養(yǎng)，長(zhǎng)2～3 cm后轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根(圖1-E)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基上保持愈傷組織狀態(tài)的材料轉(zhuǎn)移到繼代培養(yǎng)基上后仍然保持愈傷組織狀態(tài)，無(wú)法分化出芽，經(jīng)2次繼代培養(yǎng)后不再繼續(xù)培養(yǎng)(圖2-D)。

注：A為接種；B為愈傷組織的誘導(dǎo)；C為愈傷組織的生長(zhǎng)；D為愈傷組織的繼代。圖2 黃花菜種子組織培養(yǎng)只形成愈傷組織不分化為芽的各階段生長(zhǎng)情況

2.4 誘導(dǎo)生根

已經(jīng)抽生2片葉子的無(wú)根苗在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)約4 d后開(kāi)始長(zhǎng)出白色的幼根，形成完整的植株，生根率為12.5%(圖1-F)。又經(jīng)約10 d培養(yǎng)，幼苗根系繼續(xù)伸長(zhǎng)，但是長(zhǎng)勢(shì)較一般，根系較細(xì)(粗約0.2～0.3 cm)、較短(長(zhǎng)約1 cm)。此時(shí)幼苗地上部高約7 cm，具2片葉，最大葉長(zhǎng)約5 cm，寬約0.4 cm(圖1-G)。

3 討論與結(jié)論

3.1 培養(yǎng)方法與結(jié)果

黃花菜的組織培養(yǎng)技術(shù)突破了傳統(tǒng)繁殖方法受各種因素限制的生產(chǎn)模式，改依靠自然氣候條件的被動(dòng)生產(chǎn)方式為人為創(chuàng)造的有利環(huán)境條件，有利于黃花菜的工廠化育苗。本研究采用半粒法對(duì)黃花菜種子進(jìn)行組織培養(yǎng)，最終出現(xiàn)了2種結(jié)果：一部分材料成功培養(yǎng)成為完整植株；一部分材料只形成愈傷組織，不能進(jìn)一步分化并發(fā)育成完整植株，這部分材料可及時(shí)處理掉。

3.2 培養(yǎng)過(guò)程與周期

接種后約3 d材料的切口處突出乳白色的胚軸，如果不發(fā)生突出則以后也不會(huì)再有變化，因此超過(guò)3～4 d不發(fā)生突出的材料即可處理掉。轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基后約2 d乳白色的胚軸發(fā)育為淡黃色的芽，又經(jīng)3～5 d后發(fā)育為綠色的芽，將來(lái)全部發(fā)生抽葉。再經(jīng)過(guò)2次繼代培養(yǎng)后幼苗長(zhǎng)勢(shì)旺盛。葉子長(zhǎng)2～3 cm后即可轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，經(jīng)4 d后長(zhǎng)出乳白色的幼根，但根的誘導(dǎo)成功率較低，誘導(dǎo)出的根不斷生長(zhǎng)，葉子也在逐漸伸長(zhǎng)。

3.3 污染問(wèn)題

本研究最初采用帶種皮的種子進(jìn)行試驗(yàn)，培養(yǎng)過(guò)程中材料幾乎全部被污染。經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，證明污染原因是種皮上帶有雜菌。因此，本研究最終采用去除種皮的種子進(jìn)行試驗(yàn)，并將去皮種子進(jìn)行2次滅菌，滅菌效果極好，污染率降低為0，成功地解決了污染嚴(yán)重的問(wèn)題。

3.4 研究結(jié)論

本研究以大同黃花菜種子的胚芽端為外植體，并采用MS作為種子培養(yǎng)基，MS+6-BA(2 mg/L)+NAA(0.1 mg/L)作為誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)基，1/2 MS+NAA(0.2 mg/L)作為生根培養(yǎng)基進(jìn)行組織培養(yǎng)，獲得了完整的植株，證明采用半粒法進(jìn)行組織培養(yǎng)可以實(shí)現(xiàn)黃花菜的快速繁殖。其組培苗的發(fā)生途徑為：胚芽端→胚軸突出→分化出芽→抽生葉片→誘導(dǎo)生根→幼苗。

蘇承剛等[13]以根狀莖為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，再生的黃花菜幼苗長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，但只有取春季剛長(zhǎng)出的幼嫩根狀莖，才易于培養(yǎng)。趙國(guó)林等[18]、朱靖杰等[19]、唐世建等[14]以花器官為外植體進(jìn)行組織培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)花莖、花柄、花蕾都能形成完整的黃花菜植株，但花器官的取材受到開(kāi)花季節(jié)的限制，難以實(shí)現(xiàn)種苗的大規(guī)模工廠化生產(chǎn)。半粒法不僅不受季節(jié)的限制，而且能夠成功誘導(dǎo)出愈傷組織和完整植株，是一種比較簡(jiǎn)單實(shí)用快速的植株再生方法。