自然脫水對(duì)沙芥種子抗氧化系統(tǒng)的影響

， ， ， 鳳蘭

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古野生特有蔬菜種質(zhì)資源與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 呼和浩特 010019)

沙芥為十字花科沙芥屬2年生草本植物[1]，是一種集食用、飼用、藥用、保健、防風(fēng)固沙于一體的多功能沙生蔬菜，也是一類藥食同源沙生蔬菜植物，具有較高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值和生態(tài)環(huán)保價(jià)值[2-3]。沙芥以其天然無(wú)公害、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、藥食同源、風(fēng)味獨(dú)特而日益受到人們的青睞。由于長(zhǎng)期對(duì)野生沙芥的掠奪性采挖及生態(tài)環(huán)境逐漸惡化，導(dǎo)致沙芥在自然界的分布連年減少，制約了沙芥種質(zhì)資源的可持續(xù)開(kāi)發(fā)和利用。前期研究發(fā)現(xiàn)沙芥種子發(fā)芽率和出苗率均較低，在室溫貯藏條件下，沙芥種子平均壽命為4～5年[4]，種子的貯藏直接影響其種子壽命和生產(chǎn)使用。趙鵬等采用硅膠干燥法將沙芥種子(4.5%)的含水量降至3.1%、2.2%、1.3%，測(cè)定不同含水量條件下種子的生活力及抗氧化代謝的變化，研究了超干處理對(duì)沙芥種子活力的影響[5-6]，而有關(guān)自然脫水階段沙芥種子抗氧化特性的變化還未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)將完全成熟的沙芥種子通過(guò)自然風(fēng)干脫水處理獲得不同含水量種子，并測(cè)定其發(fā)芽特性以及抗氧化系統(tǒng)的變化趨勢(shì)，分析和探討沙芥種子自然脫水階段的脫水耐性，為沙芥屬植物的種子發(fā)芽與休眠、種子壽命與貯藏等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

沙芥(Pugioniumcornutum(L.) Gaertn.)種子，采集于鄂爾多斯市鄂托克前旗毛烏素沙地，初始含水量為(8.8±0.19)%，千粒重為(30.52±0.55)g。

1.2 處 理

將采摘的新鮮成熟的沙芥屬植物種子去除種殼整理干凈，挑選出凈種子30 g左右(共6份)裝入尼龍網(wǎng)袋置于室內(nèi)平臺(tái)上鋪成均勻的1層，室溫(25±2)℃條件下自然風(fēng)干脫水，稱重法控制種子水分散失程度。沙芥種子初始含水量為8.8%，自然脫水至7.8%、6.8%、5.8%、4.8%、4.0%共6個(gè)不同含水量。自然脫水后的種子用2層鋁箔袋密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 方 法

1.3.1 種子脫水速率的測(cè)定

參照孔德娟等[7]的方法，將初始含水量為8.8%的沙芥種子室溫條件下自然風(fēng)干脫水，每隔1 d用分析天平稱重，記錄水分散失情況，計(jì)算種子含水量的變化，重復(fù)4次，用來(lái)測(cè)定種子脫水速率的變化趨勢(shì)。

1.3.2 種子發(fā)芽指標(biāo)的測(cè)定

種子含水量的測(cè)定采用烘箱干燥法[8]，種子發(fā)芽試驗(yàn)參照宋兆偉等[9]的方法，以胚根突破種皮為標(biāo)準(zhǔn)記為發(fā)芽。種子發(fā)芽率是統(tǒng)計(jì)10 d所有發(fā)芽的種子數(shù)在供試種子數(shù)中所占的百分比，根據(jù)第5天的發(fā)芽率測(cè)定第5天的種子發(fā)芽勢(shì)，種子發(fā)芽指數(shù)的測(cè)定參照宋松泉等[8]的方法。

1.3.3 種子抗氧化系統(tǒng)的測(cè)定

酶液提取：隨機(jī)選取各處理種子0.2 g，加5 mL Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(PBS，50 mmol/L，pH=7.0)冰浴勻漿。4 ℃下15 000 r/min離心20 min，提取上清液用于各酶活性及丙二醛含量的測(cè)定，各處理均4次重復(fù)。

超氧陰離子自由基(superoxide anion free radical,O2·-)產(chǎn)生速率采用王愛(ài)國(guó)等[10]的鹽酸羥胺法；丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量采用李合生的硫代巴比妥酸(TBA)法[11]；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性采用李合生的氮藍(lán)四唑(NBT)法[11]；過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)活性采用陳建勛的愈創(chuàng)木酚法[12]；過(guò)氧化氫酶(catalase,CAT)活性采用陳建勛的紫外分光光度計(jì)法[12]；抗壞血酸過(guò)氧化物酶(ascorbate peroxidase,APX)活性參考Nakano等[13]的方法；谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase,GR)活性參考Ma等[14]的方法；多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性參考劉萍的方法[15]；脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)活性參考張志良等[16]的方法；維生素C(vitamin C,Vc)含量采用李合生的2,6-二氯酚靛酚法[11]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2013軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、圖表制作，采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙芥種子的自然脫水速率變化

如圖1所示，沙芥種子的自然脫水過(guò)程含水量變化符合多項(xiàng)式 3 階的變化趨勢(shì)，初始含水量8.8%的沙芥種子在室溫條件下自然脫水需要22周才能降到種子含水量為4.0%的穩(wěn)定狀態(tài)。在脫水初期，沙芥種子的含水量下降較快，種子自然脫水速率較大，到脫水后期，種子含水量下降比較緩慢，種子自然脫水速率基本趨于平穩(wěn)。表明在脫水的過(guò)程中，沙芥種子自然脫水速率的變化趨勢(shì)為先快后慢最后逐漸穩(wěn)定。

2.2 自然脫水對(duì)沙芥種子發(fā)芽指標(biāo)的影響

如表1所示，在含水量8.8%(ck)時(shí)，沙芥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均最低，隨著含水量的降低，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均依次升高，當(dāng)含水量在4.0%時(shí)，發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽指數(shù)均達(dá)到最大值。沙芥種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)在7.8%、6.8%時(shí)，與ck相比較，差異不顯著，但均高于ck；5.8%、4.8%、4.0%之間差異不顯著，但均顯著高于ck；當(dāng)種子含水量低于5.8%時(shí)能顯著提高種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、

發(fā)芽指數(shù)，說(shuō)明在沙芥種子自然脫水階段隨著種子含水量的減少，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)在逐漸增加。

表1 自然脫水對(duì)沙芥種子發(fā)芽指標(biāo)的影響

處理發(fā)芽率(%)發(fā)芽勢(shì)(%)發(fā)芽指數(shù)8.8(ck)33Bc21Bc6.86Bb7.841ABbc26ABbc9.25ABb6.843ABbc26ABbc9.74ABab5.848ABab28ABab10.90Aa4.850Aab29Aab11.10Aa4.055Aa33Aa11.82Aa

注：小寫字母表示在p<0.05的水平上差異顯著；大寫字母表示

在p<0.01的水平上差異顯著。

圖1 沙芥種子自然脫水速率曲線

2.3 自然脫水對(duì)沙芥種子抗氧化酶活性的影響

2.3.1 自然脫水對(duì)沙芥種子SOD活性的影響

如圖2所示，自然脫水的沙芥種子隨著含水量的降低，種子SOD活性逐漸升高。含水量為4.8%、4.0%的種子SOD活性顯著高于ck，而含水量為7.8%、6.8%、5.8%的種子SOD活性與ck無(wú)顯著差異，結(jié)果表明，4.0%的種子SOD活性最高；含水量為4.8%、5.8%、6.8%、7.8%的種子依次降低，8.8%最低。

圖2 自然脫水對(duì)沙芥種子SOD活性的影響

2.3.2 自然脫水對(duì)沙芥種子CAT活性的影響

如圖3所示，與ck相比較，含水量為7.8%、6.8%、5.8%、4.8%、4.0%的種子CAT活性與ck相比無(wú)顯著差異。結(jié)果表明，4.0%的CAT活性最高，5.8%次之，8.8%最低；說(shuō)明自然脫水階段的沙芥種子隨著含水量的降低，種子CAT活性逐漸升高，且差異性不顯著。

圖3 自然脫水對(duì)沙芥種子CAT活性的影響

2.3.3 自然脫水對(duì)沙芥種子POD活性的影響

如圖4所示，含水量為7.8%、6.8%、5.8%、4.8%、4.0%的種子POD活性與ck相比無(wú)顯著差異，結(jié)果表明，4.0%的種子POD活性最高，7.8%次之，8.8%最低；說(shuō)明自然脫水階段的沙芥種子隨著含水量的降低，種子POD活性呈先升高后降低再升高的趨勢(shì)。

圖4 自然脫水對(duì)沙芥種子POD活性的影響

2.3.4 自然脫水對(duì)沙芥種子APX活性的影響

如圖5所示，含水量為6.8%、5.8%、4.8%、4.0%的種子APX活性顯著低于ck，7.8%與ck之間差異不顯著。自然脫水階段的沙芥種子隨著含水量的降低，種子APX活性變化呈先降低后升高的趨勢(shì)，當(dāng)沙芥種子含水量降為5.8%時(shí)，種子APX活性最低。

2.3.5 自然脫水對(duì)沙芥種子GR活性的影響

如圖6所示，含水量為7.8%、6.8%、5.8%、4.8%、4.0%的種子GR活性與ck相比無(wú)顯著差異。4.8%的種子GR活性最高，6.8%次之，7.8%最低；說(shuō)明自然脫水階段的沙芥種子隨著含水量的降低，對(duì)種子GR活性無(wú)顯著影響。

2.3.6 自然脫水對(duì)沙芥種子LOX活性的影響

如圖7所示，含水量為6.8%、5.8%、4.8%、4.0%的種子LOX活性極顯著低于ck，但7.8%與ck之間的差異不顯著，7.8%的種子LOX活性最高，8.8%次之，4.0%最低；說(shuō)明自然脫水階段的沙芥種子隨著含水量的降低，種子LOX活性總體呈逐漸降低的趨勢(shì)。

圖5 自然脫水對(duì)沙芥種子APX活性的影響

圖6 自然脫水對(duì)沙芥種子GR活性的影響

圖7 自然脫水對(duì)沙芥種子LOX活性的影響

2.3.7 自然脫水對(duì)沙芥種子PPO活性的影響

如圖8所示，含水量為7.8%、6.8%、5.8%的種子PPO活性與ck相比差異不顯著，但4.8%、4.0%時(shí)極顯著低于ck，4.8%的PPO活性顯著高于4.0%。7.8%的種子PPO活性最高，5.8%次之，4.0%最低；說(shuō)明自然脫水階段的沙芥種子隨著含水量的降低，種子PPO活性總體呈逐漸降低的趨勢(shì)，當(dāng)含水量降為4.8%時(shí)沙芥種子的PPO活性顯著下降。

2.4 自然脫水對(duì)沙芥種子MDA含量的影響

如圖9所示，含水量為7.8%、6.8%、5.8%、4.8%、4.0%的種子MDA含量與ck相比差異不顯著；7.8%的種子MDA含量最低，8.8%、6.8%、5.8%、4.8%依次升高，4.0%最高；說(shuō)明自然脫水階段的沙芥種子隨著含水量的降低，種子MDA含量總體呈逐漸升高的趨勢(shì)。

圖8 自然脫水對(duì)沙芥種子PPO活性的影響

圖9 自然脫水對(duì)沙芥種子MDA含量的影響

2.5 自然脫水對(duì)沙芥種子超氧陰離子產(chǎn)生速率的影響

如圖10所示，含水量為7.8%、6.8%、5.8%、4.8%、4.0%的種子O2·-產(chǎn)生速率與ck相比差異不顯著；7.8%的種子O2·-產(chǎn)生速率最高，6.8%最低；說(shuō)明自然脫水階段的沙芥種子隨著含水量的降低，對(duì)種子O2·-產(chǎn)生速率的影響不顯著。

圖10 自然脫水對(duì)沙芥種子超氧陰離子(O2·-)產(chǎn)生速率的影響

2.6 自然脫水對(duì)沙芥種子Vc含量的影響

如圖11所示，含水量為7.8%、6.8%、5.8%、4.8%的種子Vc含量與ck相比差異不顯著，但4.0%顯著低于ck，8.8%的種子Vc含量最高，7.8%、6.8%、5.8%、4.8%依次降低，4.0%最低；說(shuō)明自然脫水階段的沙芥種子隨著含水量的降低，種子Vc含量總體呈逐漸降低的趨勢(shì)，當(dāng)含水量降為4.0%時(shí)沙芥種子的Vc含量顯著下降。

圖11 自然脫水對(duì)沙芥種子Vc含量的影響

3 討 論

沙芥種子從初始含水量8.8%自然脫水到7.8%、6.8%、5.8%、4.8%、4.0%的過(guò)程中，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)呈逐漸升高的趨勢(shì)，說(shuō)明種子含水量的降低，增強(qiáng)了種子的發(fā)芽能力，在沙芥種子的貯藏中，應(yīng)該盡量降低種子的含水量。同時(shí)，沙芥種子最高發(fā)芽率為55%，發(fā)芽勢(shì)為33%，發(fā)芽指數(shù)為11.82，均處于較低水平，這可能與沙芥種子采收后有100 d左右的后熟期有關(guān)，在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)該盡量播種已經(jīng)完全后熟的種子，提高沙芥種子的發(fā)芽率和出苗率。

在種子自然脫水過(guò)程中，抗氧化防御系統(tǒng)的作用明顯，以酶促或非酶促保護(hù)系統(tǒng)的方式在多條途徑直接或間接地阻止、忍耐、修復(fù)自由基的攻擊，其中抗氧化酶活性的保持是種子耐干性的一個(gè)重要組成部分。自然脫水后貯藏的種子其抗氧化系統(tǒng)能有效地清除活性氧，在劣變的過(guò)程中延緩老化，提高種子的貯藏壽命。而自然脫水階段的沙芥種子隨著含水量的降低，種子SOD活性、CAT活性、POD活性呈逐漸升高的趨勢(shì)；植物細(xì)胞抵抗活性氧傷害的抗氧化系統(tǒng)中SOD、CAT和POD是植物體內(nèi)清除活性氧的3種重要酶[17]，SOD將毒性較強(qiáng)的O2·-轉(zhuǎn)化為較弱的H2O2，SOD活性的增加可有效保護(hù)自然脫水的沙芥種子免受活性氧的傷害，穩(wěn)定生物膜結(jié)構(gòu)；CAT可以清除H2O2，催化H2O2分解為H2O和O2，CAT活性的增加可以增強(qiáng)沙芥種子的酶促防御系統(tǒng)；POD是活性氧清除系統(tǒng)的一種酶，它可以通過(guò)催化酚類物質(zhì)與H2O2反應(yīng)生成醌類物質(zhì)來(lái)清除逆境和衰老過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧，從而減輕對(duì)細(xì)胞的傷害[18-19]；APX是植物活性氧代謝中重要的抗氧化酶之一，也是清除H2O2的關(guān)鍵酶，又是Vc代謝的主要酶類[18]，沙芥種子APX活性變化呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，當(dāng)沙芥種子含水量由8.8%降為5.8%時(shí)，APX活性逐漸降低，由5.8%降為4.0%時(shí)APX活性逐漸升高；抗氧化酶GR可參與抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)途徑，清除活性氧，在植物抗氧化中有重要作用[20]，沙芥種子含水量的降低對(duì)種子GR活性無(wú)明顯影響；本研究與朱力等[21]在萬(wàn)壽竹種子脫水過(guò)程中的酶活性變化趨勢(shì)相類似。沙芥種子在自然脫水過(guò)程中，抗氧化酶系統(tǒng)保持完好。

植物組織中MDA含量可以反映植物衰老和遭受逆境傷害的程度[22]，自然脫水階段的沙芥種子隨著含水量的降低，種子MDA含量總體呈逐漸升高的趨勢(shì)，但各處理之間差異不顯著；O2·-是生物體內(nèi)發(fā)生氧化反應(yīng)時(shí)氧分子得到一個(gè)電子而形成的自由基，可歧化為O2和H2O2，由于該自由基活性強(qiáng)，因此可以直接攻擊細(xì)胞內(nèi)的生物大分子，引起膜質(zhì)過(guò)氧化，沙芥種子自然脫水對(duì)O2·-產(chǎn)生速率的影響并不顯著；Vc是非酶促抗氧化系統(tǒng)中自由基的主要清除劑，種子中Vc的含量與種子的貯藏壽命密切相關(guān)[23]。自然脫水的沙芥種子Vc含量總體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，當(dāng)含水量降為4.0%時(shí)沙芥種子的Vc含量顯著下降。

4 結(jié) 論

自然脫水階段的沙芥種子隨著含水量的降低，種子SOD、POD活性逐漸升高；而CAT、LOX活性逐漸降低；APX活性變化呈先降低后升高的趨勢(shì)，當(dāng)沙芥種子含水量降為5.8%時(shí)，APX活性最低；PPO活性總體呈逐漸降低的趨勢(shì)，當(dāng)含水量降為4.8%時(shí)，沙芥種子的PPO活性顯著下降；對(duì)種子GR活性無(wú)明顯影響。隨著含水量的降低，種子MDA含量總體呈逐漸升高的趨勢(shì)，當(dāng)含水量降為5.8%時(shí)，沙芥種子的MDA含量顯著升高；而種子Vc含量總體呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，當(dāng)含水量降為4.0%時(shí)沙芥種子的Vc含量顯著下降；對(duì)種子O2·-產(chǎn)生速率的影響不顯著。

自然脫水的沙芥種子，隨著含水量的降低，種子發(fā)芽指標(biāo)增強(qiáng)，種子抗氧化系統(tǒng)活性有所增加，沙芥種子成熟采收后在自然條件下風(fēng)干脫水至最低含水量4.0%時(shí)，并不減弱沙芥種子的發(fā)芽活力和抗氧化系統(tǒng)活性，說(shuō)明自然脫水有助于沙芥種子的貯藏，沙芥種子有較強(qiáng)的耐脫水性。