外源植物激素、冷濕層積和變溫處理對懸鉤子屬光滑高粱泡種子休眠與萌發(fā)的影響

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(1.湖北民族學院，林學園藝學院，種子生物學實驗室， 湖北 恩施 445000；2.湖北省恩施土家族苗族自治州氣象局， 湖北 恩施 445000)

種子休眠是指在特定時期內，不管各種有利于種子萌發(fā)的環(huán)境因子(如溫度和光照/黑暗等)以何種組合形式都不能使其萌發(fā)的現(xiàn)象[1]。它是植物在長期的自然進化過程中形成的應對自然環(huán)境和保存種族的一種適應特性[2]，對于新物種的產(chǎn)生和現(xiàn)有物種的擴散具有重要意義[3]。而在生產(chǎn)實踐中，種子休眠對于人類來說有利有弊，利在于休眠能使種子成功度過不適宜其萌發(fā)生長的特殊時期；弊在于播種時休眠會降低種子活力、影響出苗整齊度，并嚴重制約大規(guī)模常規(guī)育種和種苗生產(chǎn)[2]。

根據(jù)休眠原因，種子休眠可以分為生理休眠、形態(tài)休眠、形態(tài)生理休眠、物理休眠和復合休眠等五大類型，每一休眠類型又可進一步分為若干休眠水平，且有些休眠水平還可進一步分為若干休眠型[1-4]。其中，生理休眠是進化上最高、系統(tǒng)發(fā)生樹上分布最廣的休眠類型[1-5]。通常，可通過溫度處理、機械處理、層積處理、光照處理、激素處理、化學藥劑處理及綜合處理等方法來解除種子休眠，使其萌發(fā)[6-8]，并可由此分析其休眠原因及確定其休眠的類型、水平和休眠型[1]。

薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus)植物全世界約有750個種，分布遍及五大洲。中國約有194個種88個變種，分布遍及全國各地[9-10]。該屬很多植物均具有開發(fā)利用價值，有些種類的果實柔嫩多汁，營養(yǎng)豐富，可食用；有些種類的果實、種子、根及葉可入藥，具有活血化瘀、清熱解毒、止血止痛等功效[10]。光滑高粱泡(RubuslambertianusSer.var.glaberHemsl.)是懸鉤子屬高粱泡(R.lambertianusSer.)的一個變種，其果實可食，可加工成果汁、果酒或提取色素用作飲料添加劑[11]；其根和葉可入藥，有活血調經(jīng)、消腫解毒的作用[12]。高粱泡的生態(tài)適應性強，是23種優(yōu)良懸鉤子種質資源之一[11-13]，極具開發(fā)潛力。

懸鉤子屬植物種子具有深度休眠特性，給選育種及物種保護等工作造成一定困難[14]，明確其休眠原因并找到高效的休眠解除方法具有重要意義。已有研究表明，懸鉤子屬植物種子休眠原因復雜多樣，包括硬質種皮(實為內果皮)妨礙透水透氣和胚生長[15-16]，種皮或胚乳內含萌發(fā)抑制物質[16-17]，胚發(fā)育不充分[14]等。用于解除懸鉤子屬植物種子休眠的方法主要有機械破皮處理、化學試劑處理、植物激素處理、低溫層積處理和變溫處理等[14]。目前有關高粱泡(R.lambertianus)種子休眠的研究鮮見報道，僅見張春紅等對高粱泡種子利用98% H2SO4和NaClO浸種后室溫沙藏(90 d)處理，但均未能有效解除休眠[18]，而對于變種光滑高粱泡種子休眠的研究尚未見報道。鑒于高粱泡的潛在利用價值，很有必要探明其種子休眠原因，并找到解除其休眠的最佳方法，為其規(guī)模繁殖和育種等工作的開展奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試光滑高粱泡種子于2017年10月采自湖北省恩施鶴峰縣木林子國家級自然保護區(qū)。去除果皮和雜質后于室溫條件下陰干備用。

1.2 方 法

1.2.1 外源植物激素處理

選擇具有促進種子休眠解除和萌發(fā)的外源植物激素GA3和6-BA對光滑高粱泡種子進行處理。2種外源植物激素溶液均配制成0.000 1，0.001，0.01，0.1 mmol/L和1 mmol/L等5種濃度，以蒸餾水處理作為對照(ck)。

1.2.2 冷濕層積處理

將新鮮成熟種子與濕潤的珍珠巖(含水量60%，握之成團，松手即散)按體積比1∶3充分混勻后裝于黑色聚乙烯袋中，隨后將其置于4 ℃黑暗條件下進行冷濕層積處理。層積2，4，6，8周后取樣，并在指定溫度和光照條件下進行萌發(fā)測試，以未經(jīng)層積處理的新鮮成熟種子為對照(ck)。

1.2.3 變溫處理

設置2種變溫：15 ℃/25 ℃和20 ℃/30 ℃，均為12 h光照/12 h黑暗交替光照條件(PPFD=121μmol/(mDK·s)，每天的光照時間與變溫的高溫階段相對應。

1.2.4 萌發(fā)測試

所有萌發(fā)測試試驗均設置4次重復，每重復50粒種子，將種子均勻播于墊有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，每皿添加6 mL蒸餾水或不同濃度的外源植物激素溶液，為防止培養(yǎng)期間水分蒸發(fā)，每個培養(yǎng)皿在添加完蒸餾水或不同濃度的外源植物激素溶液后用封口膜進行密封處理。然后置于指定溫度(恒溫或變溫)和光照[每天12 h光照/12 h黑暗交替光照，PPFD=121μmol/(m·s)]條件下進行培養(yǎng)，定期記錄萌發(fā)數(shù)，萌發(fā)測試結束后統(tǒng)計并計算最終平均萌發(fā)率。以胚根突破內果皮作為萌發(fā)標準。

表1 冷濕層積對光滑高粱泡種子在各恒溫條件下休眠解除和萌發(fā)的影響

層積時間(周)萌發(fā)率10℃15℃20℃25℃30℃35℃01.5±0.5cB20.0±5.0aB27.0±4.6aA23.0±5.9aA10.0±1.6bA1.0±0.6cA20bB9.5±1.3aB16.5±3.4aA14.0±5.0aA6.0±2.2aA0bA41.5±1.5bB18.5±4.4aB15.5±6.0aA27.0±6.5aA4.0±0.8bA0bA635.5±13.0bA55.5±5.9aA11.0±2.4bA12.0±3.8bA8.0±2.2bA0cA842.5±9.2aA50.5±10.6aA27.0±2.5abA18.0±4.1bA6.0±1.2cA0dA

注：同列標有相同大寫字母或同行標有相同小寫字母的數(shù)據(jù)間無顯著性差異(p=0.05)。

初始萌發(fā)測試：培養(yǎng)溫度分別為5，10，15，20，25，30，35 ℃和40 ℃恒溫，培養(yǎng)期為30 d。

外源植物激素處理萌發(fā)測試：培養(yǎng)溫度為20 ℃，培養(yǎng)期為60 d。

冷濕層積處理后萌發(fā)測試：冷濕層積處理不同時間的種子分別被置于10，15，20，25，30 ℃和35 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)期為30 d。

變溫處理萌發(fā)測試：培養(yǎng)期為30 d。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 22.0軟件對所有的萌發(fā)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有萌發(fā)數(shù)據(jù)均進行單因素方差分析(one-way ANOVA，p=0.05)，其中初始萌發(fā)測試、外源植物激素處理和冷濕層積處理的萌發(fā)數(shù)據(jù)隨后還要進行Student-Newman-Keuls驗后多重比較(p=0.05)。為了保證方差齊性，所有萌發(fā)數(shù)據(jù)在進行方差分析前都要先進行反正弦轉換。所有統(tǒng)計圖均通過GraphPad Prism 5.0軟件完成。

2 結果與分析

2.1 新鮮光滑高粱泡種子在恒溫條件下的初始萌發(fā)

恒溫對新鮮光滑高粱泡種子休眠解除和萌發(fā)具有顯著性影響(p<0.05,圖1)。15，20，25 ℃條件下的最終平均萌發(fā)率間無顯著性差異(p>0.05)，并顯著高于其他恒溫條件下的最終平均萌發(fā)率(p<0.05)，其中以20 ℃恒溫條件下的最終平均萌發(fā)率最高，為(27.0±4.6)%。30 ℃條件下的最終平均萌發(fā)率次之，為(10.0±1.6)%；10 ℃和35 ℃條件下的最終平均萌發(fā)率最低，不到5%，且兩者無顯著性差異(p>0.05)；5 ℃和40 ℃條件下則不萌發(fā)(圖1)。

2.2 變溫處理對新鮮光滑高粱泡種子休眠解除和萌發(fā)的影響

與20 ℃恒溫條件下的萌發(fā)進程相比，2種變溫處理均能夠有效解除光滑高粱泡種子的休眠并促進其萌發(fā)(圖2)。2種變溫處理的最終平均萌發(fā)率顯著高于20 ℃恒溫(最適恒溫，見圖1)條件下的最終平均萌發(fā)率(p<0.05)，且2種變溫處理的最終平均萌發(fā)率間無顯著性差異(p>0.05)，均達95%以上(圖2)。

注：每天12 h光照/12 h黑暗，PPFD=121 μmol/(m·s)。標有相同小寫字母的數(shù)據(jù)間無顯著性差異(p=0.05)。下同。圖1 新鮮光滑高粱泡種子在各恒溫條件下的萌發(fā)

圖2 新鮮光滑高粱泡種子在2種變溫和1種最適恒溫條件下的萌發(fā)進程

2.3 GA3和6-BA對新鮮光滑高粱泡種子休眠解除和萌發(fā)的影響

不同濃度的GA3和6-BA溶液處理的最終平均萌發(fā)率與對照相比，均沒有顯著性差異(p>0.05,圖3)。

2.4 冷濕層積處理對光滑高粱泡種子休眠解除和萌發(fā)的影響

冷濕層積處理能夠在一定程度上促進光滑高粱泡種子休眠的解除及其萌發(fā)(表1)。隨著冷濕層積處理時間的延長，光滑高粱泡種子在10 ℃和15 ℃條件下的最終平均萌發(fā)率有增加趨勢(p<0.05)，而對其他恒溫條件下的最終平均萌發(fā)率則沒有顯著性影響(p>0.05,表1)。冷濕層積6周的光滑高粱泡種子在15 ℃條件下達到最高平均萌發(fā)率，為(55.5±5.9)%(表1)。

注：萌發(fā)溫度為20 ℃，每天12 h光照/12 h黑暗交替光照，PPFD=121 μmol/(m·s)。標有相同小寫字母的數(shù)據(jù)間無顯著性差異(p=0.05)。圖3 GA3(A)和6-BA(B)溶液處理對新鮮光滑高粱泡種子休眠解除和萌發(fā)的影響

3 結論與討論

目前，關于懸鉤子屬植物種子休眠與萌發(fā)的研究結果存在很大差異。張春紅等[19]用GA3溶液處理黑莓Kiowa種子效果不明顯，而低溫層積處理則能夠有效地促進其休眠解除和萌發(fā)。這與我們在光滑高粱泡種子休眠解除和萌發(fā)實驗中所得的結果相類似。然而，龔娜等[20]卻發(fā)現(xiàn)冷濕層積處理對黑莓和樹莓早紅種子休眠解除和萌發(fā)沒有促進作用。這或許是因為種或品種不同所致，黑莓和樹莓是懸鉤子屬多種植物的統(tǒng)稱，并且已人工培育出多個品種[21]，而兩篇文獻中均未標明相應的拉丁學名；另外，即使同種植物種子，其休眠的有無及休眠原因或休眠類型也可能存在差異。同種植物種子中可能有些種子有休眠，有些種子無休眠[1]；并且，同種植物種子中也可能存在多種休眠類型[22-23]，如心葉椴(TiliacordataMill.)種子中有些是復合休眠，有些是生理休眠[23]。

根據(jù)恒溫條件下的初始萌發(fā)和冷濕層積處理試驗結果，以及Baskin等[1]的種子休眠分類系統(tǒng)，新鮮光滑高粱泡種子應該無物理休眠，即種皮(實為內果皮)不限制透水透氣，并很可能具有淺生理休眠。冷濕層積處理能夠有效促進其種子休眠的解除和萌發(fā)(表1)，然而2種外源植物激素(GA3和6-BA)處理卻無顯著效果(圖3)。淺生理休眠種子的休眠解除和萌發(fā)是能夠被GA促進的[4]，但不同種子需要不同的處理濃度，本研究可能未能找到合適的處理濃度，6-BA對種子休眠解除和萌發(fā)的促進同樣也依賴于濃度。

層積處理能夠促進很多植物種子的休眠解除[24]，如黃櫨(Cotinuscoggygria)種子的復合休眠(物理休眠+生理休眠)[25]。在本研究中，冷濕層積處理也顯著促進了光滑高粱泡種子的萌發(fā)，然而與Deng等[25]實驗中冷濕層積顯著促進了黃櫨種子在從低到高各溫度下的萌發(fā)有所不同，冷濕層積處理僅顯著提高了光滑高粱泡種子在10 ℃和15 ℃低溫下的萌發(fā)率，最終平均萌發(fā)率最高分別達到(42.5±9.2)%[未經(jīng)層積處理的對照組的平均萌發(fā)率為(1.5±0.5)%]和(55.5±5.9)%[未經(jīng)層積處理的對照組的平均萌發(fā)率為(20.0±5.0)%]，而對其在20 ℃及其以上較高溫度條件下的萌發(fā)未顯示出促進作用(表1)。這或許是因為本實驗中冷濕層積處理時間還不夠長，也或者是2種植物種子的休眠機制有所不同。

變溫處理可有效解除少數(shù)懸鉤子屬植物種子的休眠[17]。新鮮光滑高粱泡種子在15 ℃/25 ℃和20 ℃/30 ℃變溫條件下培養(yǎng)時未顯示出休眠特性，或者說2種變溫條件有效促進了休眠的解除，最終平均萌發(fā)率均達95%以上(圖2)。

綜上所述，光滑高粱泡種子應該屬于淺生理休眠類型，最佳休眠解除方法為在15 ℃/25 ℃變溫條件下處理20 d以上，其次為在4 ℃左右冷濕層積6周以上。