一種簡單、極快的植物葉片DNA提取方法

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(1.寧夏農林科學院 農業(yè)生物技術研究中心， 寧夏 銀川 750002；2.北方民族大學 生物科學與工程學院， 寧夏 銀川750021；3.寧夏農林科學院 枸杞工程技術研究所， 寧夏 銀川 750002)

DNA是分子生物學研究的主要對象之一，在植物分子生物學和遺傳育種中，基因組DNA的質量好壞是影響其成敗的關鍵因素。人們經(jīng)常需要提取高質量的植物DNA，用于構建基因文庫、基因組Sourthern 分析、酶切、克隆和測序等分子生物學實驗。根據(jù)植物的研究對象、研究目的和研究成本等不同，提取基因組DNA 所應用的方法也不同。其中，隨著作物分子輔助育種的廣泛應用與推廣，基因型鑒定是最主要的工作，基因組DNA的提取則是最繁重、最耗時的工作之一。目前提取基因組DNA的方法有： 1) CTAB提取法。此方法多用于禾本科植物基因組DNA的提取，是1987年Doyle最先應用[1],后來應用改進的CTAB法，用特定吸附作用的螯合樹脂在特定條件下，吸附、純化DNA； 2) PVP提取法。此方法主要應用于林木類植物DNA的提取，1997年Kim 最先應用此方法提取果樹和針葉類林木中高質量的DNA[2]； 3) SDS提取法。此方法適用于多種植物DNA的提取。 4) 尿素提取法。此方法適用于一般植物和真核微生物DNA的提取，1990年Dudler最先應用此方法[3-5]。這些方法均用到離心機、提取步驟繁雜、配制化學試劑種類眾多、提取過程刺激味大，缺乏高效的、快速、環(huán)保的提取植物基因DNA的方法。

本研究針對以上基因組DNA提取方法存在的不足進行改進，用時大約90 s即可完成植物葉片基因組DNA的提取，且完全可以滿足PCR反應的基因型鑒定[6]、基因克隆和測序等需要。

1 材料與方法

1.1 植物材料

選取4 mg水稻新鮮、幼嫩葉片為試驗材料。

1.2 主要試劑

植物細胞裂解液(裂解液中SDS質量百分比濃度為0.06%、 EDTA的濃度為25 mmol/L、NaCl的濃度為250 mmol/L、Tris-base 200 mmol/L， pH=8.0)；DNA漂洗液(Tris-base的濃度為10 mmol/L、Tween-20質量百分比濃度為0.15%)；2×Mixture PCR擴增試劑盒購自北京擎天生物科技有限公司；DNA Marker DL 2000，質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、DH 5 α感受態(tài)均為北京天根生化科技有限公司產品；Peasy-T載體為北京全式金生物公司產品，其它試劑為分析純；測序工作由北京擎天生物科技有限公司用ABI 3730測序儀完成。

1.3 引物序列與合成

針對水稻Actin基因設計上下游引物Actin_FPrimer，Actin_RPrimer，預計擴增大小為459 bp。針對水稻BADH2第三外顯子片段，擴增片段預計大小為431 bp。

Actin_FPrimer：TGCTATGTACGTCGCCATCCA，

Actin_RPrimer：AATGAGTAACCACGCTCCGTC，

E 3_FP： GGCATATGCGAGCATTTTAT,

E 3_RP：TAGTACCATGCTTGGGTC。

以上引物由上海捷瑞生物公司合成，用去離子水將各引物稀釋到10μM工作濃度。

1.4 植物葉片DNA提取

植物葉片DNA按以下步驟提取。

1) 水稻葉片提取材料4 mg，裝入圓底EP管中，加1粒直徑4 mm的鋼珠，將管子浸入液氮中冷卻，待徹底冷卻后(2～3 min)，快速用振蕩研磨儀(頻率25次/s，時間30 s)將植物組織打碎。

2) 加入植物細胞裂解液300μL，上下顛倒5～6次，溶液變渾濁，室溫下放置待用，即得到植物材料DNA的粗提液。若無液氮，可先用小剪刀將葉片盡可能剪碎裝入1.5 mL 尖底EP管中，然后加入500μL 植物細胞裂解液振蕩破碎組織。

3) 將干凈脫脂棉簽浸入步驟二中的DNA的粗提液3 s，將浸潤的棉簽迅速在DNA 漂洗液中輕輕漂洗3次，然后再將其在100μL 去離子水(ddH2O)或TE徹底洗脫3～5次，洗脫過的ddH2O即DNA溶液，可用于下游的分子生物學實驗。

1.5 PCR檢測

為了驗證所提DNA是否滿足PCR擴增，選取水稻肌動蛋白基因Actin設計的上述引物，預計擴增大小為459 bp。按照以下PCR反應體系配置反應液20μL：2×Mixture,10μL；Actin-FPrimer，1μL；Actin-BPrimer，1μL：上述DNA溶液2μL；ddH2O 6μL。反應程序為：預變性95 ℃，5 min；循環(huán)30個，95 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；最后延伸72 ℃，10 min。PCR產物上樣量為10μL，電壓120 V，4 CM/V；恒壓電泳30～50 min。

1.6 DNA靈敏度檢測

為了檢測其靈敏度，對所提DNA溶液進行了梯度稀釋。首先吸取2μL DNA溶液至8μL 去離子水中，再從稀釋溶液中吸取2～8μL 去離子水，依次稀釋到107。以上述依次稀釋溶液為模板進行PCR擴增。

1.7 DNA測序驗證

為了檢測此方法所提DNA是否滿足克隆、測序的需要，用E 3_FP，E 3_RP引物對水稻OsBADH2基因的片段進行擴增，預計擴增大小為431 bp，用膠回收試劑盒將其回收，然后連接Peasy-T載體，轉化DH 5 α感受態(tài)大腸桿菌，挑取陽性克隆進行測序分析。膠回收步驟、連接體系、轉化方法和質粒提取均按試劑盒說明書進行。

2 結果與分析

2.1 植物葉片DNA提取

依據(jù)以上的提取方法，得到DNA粗提液效果見圖1。圓底EP管中，溶液呈翠綠色，植物組勻漿徹底，表明使用液氮效果較好。所得DNA溶液為Ⅰ。無液氮提取效果見圖2。此方法得到的DNA粗提溶液較前法較淡，一些葉片組織明顯未被破碎。但通過延長破碎時間改善組織破碎效果。所得到DNA溶液為Ⅱ。

圖1 液氮研磨效果

圖2 無液氮研磨效果

2.2 PCR產物凝膠電泳結果

液氮研磨法和無液氮研磨法2種提取方法，分別用水稻Actin基因的上述引物進行了PCR，其產物的凝膠電泳分別見圖3和圖4。兩圖中均有459 bp條帶擴增，說明2種方法所提DNA溶液滿足基因擴增的需要。

圖3 液氮研磨法PCR擴增

圖4 無液氮研磨法PCR擴增

2.3 DNA溶液的靈敏度檢測

以液氮方法提取的DNA溶液梯度稀釋后作為模板，以水稻Actin基因設計的引物進行擴增，PCR產物凝膠電泳見圖5，從左到右稀釋倍數(shù)依次遞增。圖中結果表明，此方法提取的DNA溶液1 000萬倍稀釋，依然可以進行目的基因的PCR擴增。

圖5 DNA溶液靈敏度驗證

2.4 目標基因的測序分析

以E 3_FP，E 3_RP引物對水稻OsBADH2基因的片段擴增結果見圖6，擴增片段大小為431 bp；陽性克隆質粒的測序結果見圖7。測序峰圖清晰，經(jīng)比對完全與參考序列一致，此方法所提DNA完全滿足基因克隆、測序的需要。

圖6 OsBADH2 PCR 擴增

圖7 BADH2測序圖

3 結 論

本研究以水稻幼苗葉片為試驗材料，通過棉簽等吸附材料直接提取DNA，建立了一種簡便、快速的DNA提取方法，大大加快了分子標記輔助育種中基因型鑒定等繁鎖工作。同時，該方法對其它植物，如花生[28]，鐵皮石斛[29]、青稞[30]、燕麥[31]、南瓜[32]等葉片DNA提取有參考價值。

4 討 論

由于植物特有的細胞壁及胞內物質，很難輕易從植物中分離高產量和高質量的DNA[6]。在選取材料時，應盡可能的挑取處于生長旺盛期的幼嫩組織。這時組織中蛋白質、多糖及酚類化合物都很少，并且由于細胞多數(shù)處于分裂旺盛期，DNA的產量也會很高，幾乎所有的實驗手冊都推薦以幼嫩組織作為提取基因組DNA的首選材料[8-10]。葉片是十分理想的材料，葉片中維管組織含量少，提取效果較好。本試驗中，選用4 mg新鮮、幼嫩水稻葉片為材料。通過組織破碎，發(fā)現(xiàn)葉片量不是越多越好，材料量適合，組織破碎均勻。圓底EP管較尖底EP管效果好，鋼珠在破碎儀作用下，更能夠在狹小的空間中將葉片組織破碎。漂洗液中Tween 20的作用主要是清洗雜質。SDS是離子型表面活性劑，能溶解細胞膜上的脂質與蛋白質，從而破壞細胞膜結構；且能解聚細胞中的核蛋白，使蛋白質變性而沉淀下來。增大提取緩沖液中SDS的含量,有助于去除糖類和酚類物質[11-14]。本實驗中，沒有使用RNAase I去除DNA溶液中的RNA，這對基于PCR的基因型鑒定沒有影響。本試驗中的棉簽可以用濾紙等具有吸附作用的材料代替，作者用少量Whatman G/A 玻璃纖維濾紙固定在牙簽頭上，使用本方法提取步驟同樣獲得可以直接用于PCR擴增的DNA。對于提取其他植物葉片組織或者其它組織DNA及其下游基因克隆等分子生物學操作，同樣可以借鑒本方法[15-27]。