超量表達(dá)NtHAK1基因煙草農(nóng)藝性狀及光合特性研究

, , , , ,2

(1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院,貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/山地植物資源保護(hù)與種質(zhì)創(chuàng)新省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州省山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程2011協(xié)同創(chuàng)新中心, 貴陽 550025;2.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院, 貴陽 550006)

鉀(potassium)是植物生長發(fā)育所必需的三大礦質(zhì)元素之一，在植物體代謝過程中扮演著重要角色。有研究證明，鉀可作為植物體內(nèi)多達(dá)60余種酶的活化劑[1]，促進(jìn)蛋白質(zhì)、糖類的合成與轉(zhuǎn)運(yùn)[2]；是調(diào)節(jié)植物細(xì)胞滲透勢、維持細(xì)胞膨壓的重要元素，參與葉片及氣孔的運(yùn)動和細(xì)胞伸長等過程[3]。煙草(NicotianatabacumL.)，為茄科一年生或有效多年生草本植物，是我國的重要經(jīng)濟(jì)作物之一，種植面積和總產(chǎn)量居世界首位[4]，同時(shí)煙草作為喜鉀的典型作物，其產(chǎn)量及品質(zhì)與其鉀含量密切相關(guān)[5]。鉀含量高的煙葉呈深橘色，香氣足，吃味醇和，富有彈性和韌性，填充性好，陰燃持火力和燃燒性好[6]。國際市場上的優(yōu)質(zhì)煙葉鉀含量多大于2.5%，而我國煙葉鉀含量卻很少超過2%[7]。鉀素在土壤中以氯化鉀、硝酸鉀、硫酸鉀等鹽類形式存在，在水中鉀鹽解離成離子形式后被植物的根部吸收。研究表明，在缺鉀土壤中增施鉀肥可極顯著地增加作物產(chǎn)量[8]；在中高等施鉀水平條件下，早施追肥和分期施肥有利于煙葉品質(zhì)及產(chǎn)量的提高[9]；在同等養(yǎng)分輸入條件下，礦物態(tài)鉀肥對作物生物量和鉀營養(yǎng)吸收沒有效果，而水溶態(tài)鉀肥和構(gòu)溶態(tài)鉀肥均能顯著提高作物的生物量、鉀素含量及鉀素積累量[10]。選擇合適的種植土壤及合理使用鉀肥均對提高煙葉的鉀含量具有重要意義。然而，我國的植煙土壤都處于低鉀狀態(tài)且我國鉀肥資源的缺乏限制了對鉀肥的大量施用。因此，通過基因工程育種方法提高煙草植株對土壤中鉀離子的吸收利用能力，對提高我國煙葉鉀含量具有重要意義。高等植物的鉀離子高親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(high-affinity potassiumion transporter protein,HAK)是KUP/HAK/KT鉀通道蛋白家族中的一員，該家族蛋白能夠介導(dǎo)植物根細(xì)胞對鉀離子的高親和吸收與積累，并響應(yīng)外界環(huán)境對植物造成的低鉀脅迫等[11-12]。譚穎等[13]分別將含有pSH 737和pSH-TH植物表達(dá)載體的工程農(nóng)桿菌通過共轉(zhuǎn)化法遺傳轉(zhuǎn)化煙草K 326葉片，獲得了多個能夠富集鉀素的煙草株系。

本研究以共轉(zhuǎn)化法獲得的超量表達(dá)煙草HAK1的轉(zhuǎn)基因煙草為材料，對其不同時(shí)期的形態(tài)學(xué)指標(biāo)、光合特性參數(shù)及鉀離子含量進(jìn)行了測定，為篩選具有較強(qiáng)光合能力且不含選擇標(biāo)記的煙草新種質(zhì)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試材料普通煙草品種K 326由貴州省煙草科學(xué)研究院提供；轉(zhuǎn)鉀離子高親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HAK 1)基因煙草株系100-23、59-10均由貴州省農(nóng)業(yè)生物工程研究院保存并提供；鉀測試盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方 法

1.2.1 植株形態(tài)指標(biāo)的測定

對種植于同一實(shí)驗(yàn)基地(土壤pH值為7.2，有機(jī)質(zhì)含量為18.3 g/kg，全氮為1.03 g/kg，全磷為1.23 g/kg，全鉀為18.2 g/kg，堿解氮為0.082 g/kg，速效磷為0.021 g/kg，速效鉀為0.053 g/kg)的轉(zhuǎn)基因株系100-23、59-10和野生型K 326，分別在長至團(tuán)棵期、旺長期和成熟期時(shí)的植株形態(tài)學(xué)指標(biāo)，包括株高、莖圍、葉長、葉寬和葉片數(shù)等進(jìn)行觀察記錄。測定方法按煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)方法(YC/T 142-2010)[14]進(jìn)行測定。

1.2.2 光合特性參數(shù)的測定

光合特性參數(shù)的測定參照孫洪榮等[15]的方法，利用LI-6400便攜式光合作用測定系統(tǒng)，分別以種植于實(shí)驗(yàn)基地的生長良好、長勢一致的同一時(shí)期的轉(zhuǎn)基因煙草株系100-23和59-10從下至上第6片完展葉為材料，進(jìn)行凈光合速率(net photosynthetic rate,Pn)、氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance,Gs)等光合特性指標(biāo)的測定，同時(shí)以相同株齡野生型煙草同一葉位的展葉作為對照。在無雨日的自然條件下測定，時(shí)間為10:00—18:00，每個株系各選3株，每隔1 h測定1次，每次測定重復(fù)3次。

表1 轉(zhuǎn)基因煙草株系和野生型煙草不同時(shí)期的農(nóng)藝性狀

團(tuán)棵期 旺長期 成熟期 WT59-10100-23WT59-10100-23WT59-10100-23株 高26.62±6.25A14.50±2.27B14.84±0.78B62.48±7.40a68.60±5.31a65.26±6.07a109.34±8.74a112.57±7.35a106.96±5.30a莖圍18.84±1.52A13.77±2.70B14.17±1.02B24.97±1.18a25.72±1.82a23.78±1.09a29.13±1.01A29.51±0.82A26.85±0.82B葉長34.00±2.58A28.08±1.49B26.18±2.11B46.04±2.82a46.90±1.06a45.90±0.76a53.04±3.76a53.50±2.26a52.94±1.79a葉寬21.22±2.35A15.10±1.61B14.04±2.18B23.92±2.42a26.00±0.52a24.82±2.58a26.72±1.83a27.23±0.60a27.52±2.10a葉片數(shù)15±1.73A11.25±0.96B11.80±1.10B21.4±1.52C26.33±1.15A24.80±0.45AB29.20±1.79a27.67±2.08a29.00±1.55a

注：表中小寫字母、大寫字母分別為0.05及0.01水平上的顯著性差異。

1.2.3 鉀離子含量的測定

在堿性介質(zhì)中，經(jīng)蛋白沉淀劑處理后的組織樣本中的鉀離子與NA-TPB反應(yīng)產(chǎn)生混濁并有穩(wěn)定的懸浮液。懸浮液與樣本中鉀離子濃度成正比。準(zhǔn)確稱取組織重量，按重量(g)∶體積(mL)=1∶9的比例加入9倍的去離子水，冰水浴勻漿，2 500 r/min 離心10 min，取上清液20μL加蛋白沉淀劑180μL，3 500 r/min 離心5 min，取上清50μL進(jìn)行測定。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft office Excel 2016軟件和SPSS 22.0軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測定

分別于團(tuán)棵期、旺長期、成熟期3個時(shí)期對轉(zhuǎn)基因株系59-10、100-23和野生型K 326進(jìn)行株高、莖圍、葉長、葉寬、葉片數(shù)等形態(tài)學(xué)指標(biāo)的測定(表1)。結(jié)果顯示：團(tuán)棵期，轉(zhuǎn)基因株系59-10和100-23的株高、莖圍、葉長、葉寬、葉片數(shù)的測定值分別為14.50 cm、13.77 cm、28.08 cm、15.10 cm、11.25片和14.84 cm、14.17 cm、26.18 cm、14.04 cm、11.80片，兩株系間差異達(dá)到顯著水平，但均極顯著地低于野生型K 326對應(yīng)的測定值；旺長期，株系59-10葉片數(shù)的平均值比K 326高23.05%，株系100-23葉片數(shù)的平均值比K 326高15.89%，均達(dá)到極顯著水平，其它各項(xiàng)指標(biāo)均表現(xiàn)為差異不顯著；成熟期，株系100-23的莖圍測定平均值比K 326低7.81%，比株系59-10低8.99%，均達(dá)到極顯著水平，其余株高、葉長、葉寬、葉片數(shù)等形態(tài)學(xué)指標(biāo)均表現(xiàn)為差異不顯著。

2.2 光合特性指標(biāo)

2.2.1 不同煙草株系凈光合速率日變化

凈光合速率日變化的測定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系100-23、59-10和野生型品種K 326整體上均呈現(xiàn)10：00—15：00時(shí)間段內(nèi)先上升后下降、15：00—18：00時(shí)間段內(nèi)再上升再下降的趨勢；三者均在13：00時(shí)達(dá)到第一次峰值和16：00時(shí)達(dá)到第二次峰值，分別為22.15，21.95，21.17μmol/(m2·s)和19.29，19.88，19.28μmol/(m2·s)；10：00—15：00時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系100-23的平均凈光合速率比野生型品種K 326高7.51%，轉(zhuǎn)基因株系59-10比K 326高2.91%；15：00—18：00時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系100-23的平均凈光合速率比野生型品種K 326高12.12%，轉(zhuǎn)基因株系59-10比K 326高5.82%；在12：00、15：00、17：00時(shí)等3個時(shí)間點(diǎn)的凈光合速率測定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因株系100-23均表現(xiàn)為極顯著地高于野生型品種K 326。

注：N=3;p<0.05(*),p<0.01(**) 。下同。圖1 不同煙草株系凈光合速率日變化

2.2.2 不同煙草株系氣孔導(dǎo)度日變化

氣孔導(dǎo)度日變化的測定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系100-23、59-10和野生型品種K 326的整體趨勢基本一致，均接近于雙峰曲線，且株系100-23的曲線整體在K 326的曲線之上。10：00—15：00時(shí)，100-23的平均凈光合速率比K 326高25.18%，59-10比K 326高10.31%；15：00—18：00時(shí)，100-23的平均凈光合速率比K 326高41.76%，59-10比K 326高17.53%；13：00—17：00時(shí)，株系100-23的氣孔導(dǎo)度測定值均極顯著地高于K 326對應(yīng)的測定值。

圖2 不同煙草株系氣孔導(dǎo)度日變化

2.2.3 不同煙草株系胞間CO2濃度日變化

胞間CO2濃度日變化的測定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系100-23、59-10和野生型品種K 326三者在測定時(shí)間內(nèi)的變化趨勢基本一致，均為自10：00時(shí)起緩慢下降至15：00時(shí)稍有回升，接著又繼續(xù)緩慢下降至17：00時(shí)后再次開始回升；10：00—18：00時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系100-23的曲線整體居于K 326的曲線之上，且自13：00時(shí)起兩者之間的差異一直處于顯著或極顯著水平。

圖3 不同煙草株系胞間CO2濃度日變化

2.2.4 不同煙草株系蒸騰速率日變化

蒸騰速率日變化的測定結(jié)果顯示，10：00—18：00時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系100-23的平均蒸騰速率比K 326高11.94%，轉(zhuǎn)基因株系59-10的平均蒸騰速率比K 326高10.86%，三者均在14：00時(shí)第1次達(dá)到最大峰值，分別為8.34，9.53，9.02 mmol/(m2·s)。14：00—18：00時(shí)，3個株系蒸騰速率均呈先下降后上升再下降的趨勢，轉(zhuǎn)基因株系100-23在17：00時(shí)再次達(dá)到最大峰值9.67 mmol/(m2·s)，59-10和K 326在16：00時(shí)再次達(dá)到最大峰值，分別為8.81，8.21 mmol/(m2·s)。

2.3 煙株鉀離子含量的測定

2.3.1 團(tuán)棵期不同株系煙草鉀離子含量的測定

由圖5可知，團(tuán)棵期，3種不同株系煙草的鉀離子含量由高到低的順序是59-10>K 326>100-23；方差分析結(jié)果顯示，3種不同煙草株系中兩兩之間差異達(dá)到極顯著水平，即轉(zhuǎn)基因煙草株系59-10的鉀含量極顯著地高于野生型煙草品種K 326，轉(zhuǎn)基因煙草株系100-23的鉀離子含量極顯著地低于野生型煙草品種K 326。

圖4 不同煙草株系蒸騰速率日變化

圖5 團(tuán)棵期不同株系煙草的鉀含量比較

2.3.2 開花期不同株系煙草鉀離子含量的測定

由圖6可知，開花期，3種不同株系煙草的鉀離子含量由高到低的順序?yàn)?00-23> K 326>59-10；方差分析結(jié)果顯示，3種不同煙草株系中兩兩之間差異達(dá)到極顯著水平，即轉(zhuǎn)基因煙草株系100-23的鉀含量極顯著地高于野生型煙草品種K 326，轉(zhuǎn)基因煙草株系59-10的鉀離子含量極顯著地低于野生型煙草品種K 326。

圖6 開花期不同株系煙草的鉀含量比較

3 結(jié)論與討論

鉀是植物生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素之一，也是植物體內(nèi)含量最為豐富的陽離子。對酶的活化作用是鉀在植物體內(nèi)最重要的功能之一，目前已知植物體內(nèi)受到鉀直接或間接活化作用影響的酶超過60種，包括丙酮酸羧化酶、谷氨酰胺合成酶等合成酶類，氧化酶、脫氫酶組成的氧化還原酶類，丙酮酸激酶、肽基轉(zhuǎn)移酶等轉(zhuǎn)移酶類[16]。煙草作為典型的喜鉀作物，鉀素不僅對最終的煙葉品質(zhì)起著重要作用，而且在煙草植株生長過程中，鉀營養(yǎng)元素的含量顯著影響著其光合作用過程，決定了光合作用能量物質(zhì)轉(zhuǎn)化率[17]。研究表明，光合面積(影響光能截獲)的降低和光合同化能力的下調(diào)是缺鉀脅迫影響植物光合作用和限制其生長的兩個重要原因[18-20]。

本研究以轉(zhuǎn)高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HAK 1)基因煙草為材料，研究該基因?qū)Σ煌瑫r(shí)期各株系的形態(tài)學(xué)指標(biāo)、光合特性指標(biāo)及鉀離子含量的影響。發(fā)現(xiàn)2個轉(zhuǎn)基因株系59-10和100-23的各形態(tài)指標(biāo)的測量結(jié)果在團(tuán)棵期表現(xiàn)為顯著低于對照組K 326的相應(yīng)測量值，而至旺長期及成熟期時(shí)，這些差異則在慢慢消失，且在旺長期各株系的葉寬、葉長均表現(xiàn)為差異不顯著時(shí)，轉(zhuǎn)基因株系59-10、100-23的葉片數(shù)則均極顯著地多于對照組K 326，大大提高了轉(zhuǎn)基因植株的光合面積。轉(zhuǎn)基因株系59-10、100-23的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、胞間CO2濃度和蒸騰速率均表現(xiàn)為整體上高于對照組K 326。研究表明，缺鉀脅迫下，植物葉片中葉綠素含量下降、二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)活性減小、光合同化產(chǎn)物積累并反饋抑制葉片凈光合速率[21]。因此，本研究中的轉(zhuǎn)基因煙株可能因具較高的富鉀能力，緩解了低鉀土壤對煙株的脅迫，促進(jìn)了煙株葉片葉綠素的生成量和穩(wěn)定性，加速了光合電子的傳遞及光合磷酸化，提高了光合磷酸化能力，提高了光合關(guān)鍵酶Rubisco和Rubisco活化酶(RCA)的含量和活性，且加速了碳水化合物的轉(zhuǎn)移與分配，從而削弱了光合同化產(chǎn)物積累對葉片凈光合速率的抑制作用。鉀離子可通過調(diào)節(jié)植物的氣孔開閉機(jī)制，改變CO2進(jìn)入葉肉細(xì)胞間隙的氣孔阻力，葉片鉀離子濃度的提高促使保衛(wèi)細(xì)胞吸收更多的水分以保障氣孔的開放，從而促進(jìn)葉片對CO2的吸收和同化，因此，氣孔導(dǎo)度與葉片鉀含量之間存在著顯著的正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)葉片中的鉀充足時(shí)，能夠調(diào)節(jié)氣孔的規(guī)律性開放，提高蒸騰速率。

轉(zhuǎn)基因株系間往往也存在差異，可能是由于外源基因整合位點(diǎn)的差異造成的。從分子生物學(xué)角度來看，當(dāng)轉(zhuǎn)移一個外源基因到另一個物種基因組中時(shí)，外源基因進(jìn)入染色體上，它除產(chǎn)生了此基因編碼的外源蛋白或酶外，該外源蛋白或酶通過一系列的反應(yīng)也會導(dǎo)致其他酶或蛋白質(zhì)活性的增強(qiáng)或降低；另外，當(dāng)外源基因嵌入在染色體的某個區(qū)段時(shí)，必將對整個染色體產(chǎn)生影響，從而影響該染色體上其他基因的活性或調(diào)控機(jī)制。本研究中，轉(zhuǎn)基因株系59-10和100-23的凈光合速率、氣孔導(dǎo)度等指標(biāo)測定值也存在著不同程度的差異，具體原因仍有待進(jìn)一步研究。本研究中的轉(zhuǎn)高親和鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(HAK 1)基因煙草株系與對照組K 326相比，具有較強(qiáng)的光合能力，為創(chuàng)制轉(zhuǎn)基因安全的煙草新種質(zhì)提供參考。