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    理氣散結(jié)浸膏對(duì)小鼠和大鼠急性毒性研究

    2018-12-05 01:27:36魏譚軍胡鳳嬌王張肖成宋文杰周殿儒孫位軍王毅
    中藥與臨床 2018年3期
    關(guān)鍵詞:生化學(xué)生藥理氣

    魏譚軍,胡鳳嬌,王張,肖成,宋文杰,周殿儒,孫位軍,王毅

    理氣散結(jié)浸膏,由柴胡、香附、延胡索、甘草、青皮、蜂房、山慈菇、川芎、當(dāng)歸、白芍等組成,具有理氣調(diào)血、散結(jié)止痛的功效,主治肝郁血瘀,乳腺增生,乳癖結(jié)塊,乳癰初起,乳房脹痛。此劑型為理氣散結(jié)丸的改良劑型,原劑型是達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院臨床使用20余年的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑,系藥材直接打粉后制成的大蜜丸,存在服用劑量大、口感差、運(yùn)輸攜帶保存不便、起效緩慢、患者依從性不好、原粉入藥微生物易超標(biāo)等缺點(diǎn),不僅給患者帶來不便,也限制了該藥的推廣。此次改良劑型,可以更優(yōu)化的保存藥效、穩(wěn)定質(zhì)量、減小服用量,便于臨床應(yīng)用,擴(kuò)大市場(chǎng)規(guī)模,受眾更廣。

    根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局制定的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑注冊(cè)管理辦法》(試行,局令第20號(hào),2005年[4];征求意見稿, 2015年[5])和四川省食品藥品監(jiān)督管理局制定的《四川省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑研究技術(shù)指南(試行版)》(2014年)[6],理氣散結(jié)顆粒擬申請(qǐng)四川省醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥制劑批文,因該處方組成含有法定標(biāo)準(zhǔn)中標(biāo)識(shí)有毒性或現(xiàn)代毒理學(xué)證明有毒性的藥材,如山慈菇和蜂房[7],故需開展急性毒性實(shí)驗(yàn)研究,可為長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)和主要藥效學(xué)研究中的劑量設(shè)置提供依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗(yàn)藥物

    理氣散結(jié)浸膏,生產(chǎn)批號(hào)為151125,由達(dá)州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院生產(chǎn)。按照理氣散結(jié)顆粒的最大給藥濃度和最大給藥體積分別給予小鼠和大鼠后,給藥劑量較低,不足以充分暴露其毒性,故改用理氣散結(jié)浸膏(僅未添加制備成顆粒的輔料糖粉和糊精),盡可能的以實(shí)驗(yàn)可操作的最大濃度開展急性毒性實(shí)驗(yàn)。

    生理鹽水:規(guī)格為500 mL:4.5 g,批號(hào)為C151136,由昆明南疆制藥有限公司生產(chǎn)。

    1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

    SPF級(jí)KM種小鼠和SD大鼠各40只,全雌,體重為20±2 g、200±20 g,由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK(川)2015-030,《四川省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證》號(hào):№51203500000542。

    動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施、場(chǎng)地由成都中醫(yī)藥大學(xué)提供。

    1.3 試劑

    血常規(guī)試劑:溶血?jiǎng)ㄅ?hào)1608014)、稀釋劑(批號(hào)1607022)、清洗劑(批號(hào)1608018)。

    血液生化學(xué)試劑:谷丙轉(zhuǎn)氨酶(批號(hào)1612118)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(批號(hào)1611104)、堿性磷酸酶(批號(hào)1603110)、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(批號(hào)1605132)、總膽紅素(批號(hào)1603111)、總蛋白(批號(hào)1611109)、白蛋白(批號(hào)1604101)、尿素氮(批號(hào)1604212)、肌酐(批號(hào)1609114)、膽固醇(批號(hào)1610110)、甘油三脂(批號(hào)1612101)、葡萄糖(批號(hào)1603114)、肌酸激酶(批號(hào)1605135)。

    血常規(guī)試劑和血液生化學(xué)試劑均購(gòu)自上海特康科技有限公司。

    1.4 儀器

    全自動(dòng)生化分析儀,型號(hào)TC6010L,產(chǎn)自上海特康科技有限公司;全自動(dòng)三分群血液分析儀,型號(hào)TEK-Ⅱ MINI,產(chǎn)自上海特康科技有限公司。

    1.5 實(shí)驗(yàn)方法

    1.5.1 預(yù)實(shí)驗(yàn) 小鼠和大鼠分別按最大給藥容積40和20 mL﹒kg-1給予最大濃度2.4365 g原生藥材/mL的理氣散結(jié)浸膏溶液后,動(dòng)物仍未出現(xiàn)死亡,故給予理氣散結(jié)浸膏原液無法測(cè)出LD50。因此,按《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》的要求,依據(jù)“動(dòng)物能耐受的最大給藥容積、最大給藥濃度的藥量單次或24 h內(nèi)多次(2~3次)給藥”的規(guī)定,采用最大給藥量法評(píng)價(jià)理氣散結(jié)浸膏的急性毒性[3]。

    1.5.2 動(dòng)物分組 將實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠按體重分層,隨機(jī)分為空白對(duì)照組和理氣散結(jié)浸膏組,每組20只,試驗(yàn)前禁食16小時(shí),但不禁水。

    1.5.3 給藥方法 經(jīng)預(yù)試結(jié)果可知,理氣散結(jié)浸膏組小鼠可按照最大容積(40 mL﹒kg-1)、最大給藥濃度2.4365 g生藥/mL一次性灌胃給藥,即給藥劑量為97.46 g生藥/(kg.d);理氣散結(jié)浸膏組大鼠可按照最大容積(20 mL﹒kg-1)、最大給藥濃度2.4365 g生藥/mL分兩次灌胃給藥,每次間隔4 h,即給藥劑量為48.73 g生藥/(kg﹒d)??瞻讓?duì)照組均給予最大容積的生理鹽水。給藥后1 h內(nèi),觀察并記錄動(dòng)物是否出現(xiàn)中毒反應(yīng)以及中毒反應(yīng)的出現(xiàn)時(shí)間、維持時(shí)間、是否可逆及嚴(yán)重程度,分析可能的靶器官、組織或系統(tǒng)。后每天觀察1次,連續(xù)觀察14天。

    1.5.4 觀察指標(biāo)

    1.5.4.1 一般狀況觀察 觀察并記錄各組每只動(dòng)物有無異常,注意有無顫抖、震顫、抽搐、流涎、腹瀉、少動(dòng)、精神萎靡不振、昏迷等毒性反應(yīng)癥狀。同時(shí)觀察中毒反應(yīng)的出現(xiàn)時(shí)間、維持時(shí)間、是否可逆及嚴(yán)重程度,分析可能的靶器官、組織或系統(tǒng)。

    1.5.4.2 體重和飼料消耗量 在給藥前1天、給藥當(dāng)天、給藥后第7天和第14天時(shí),觀察和記錄各組動(dòng)物的體重(g)變化及進(jìn)食(飼料消耗量,g/(kg﹒d))情況。

    1.5.4.3 血常規(guī)和血液生化學(xué)檢測(cè) 在給藥后第14天時(shí),觀察未死亡動(dòng)物的一般情況、天然孔道情況,然后小鼠摘眼球取血,其中每組的10只小鼠取0.5~1 mL抗凝處理,另10只小鼠取0.5~1 mL凝固后分離血清0.3~0.5 mL;大鼠以3 mL﹒kg-1腹腔注射10%的水合氯醛麻醉后,經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,其中取0.5~1 mL抗凝處理,另取0.5~1 mL凝固后分離血清0.3~0.5 mL,檢測(cè)相應(yīng)血常規(guī)和血液生化學(xué)指標(biāo)。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)應(yīng)用

    運(yùn)用SPSS 19.0計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn);以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 一般狀況和尸檢結(jié)果

    灌胃30 min~1 h內(nèi),小鼠和大鼠均出現(xiàn)精神萎靡、行動(dòng)遲緩、鼻尖微微發(fā)紅的癥狀,但很快恢復(fù)正常,觀察期內(nèi),無動(dòng)物死亡。尸檢,臟器均未出現(xiàn)肉眼可見病變。

    2.2 體重及飼料消耗量

    2.2.1 小鼠 與給藥前一天比較,給藥后第1、7、14天,各組小鼠的體重及飼料消耗量均存在顯著性差異(P<0.05,P<0.01);與空白對(duì)照組比較,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見表1、表2。

    表1 小鼠體重的變化情況(g, ±S)

    表1 小鼠體重的變化情況(g, ±S)

    注:與給藥前1天比較,# P<0.05,## P<0.01;與空白對(duì)照組比較,* P<0.05,** P<0.01

    組別 劑量g生藥﹒kg-1﹒d-1 給藥前1天 給藥后第1天 給藥后第7天 給藥后第14天空白對(duì)照組(n=20) —— 23.06±1.10 23.84±1.20# 26.20±1.53## 27.88±1.55##理氣散結(jié)浸膏組(n=20) 97.46 23.40±0.86 24.37±0.90## 25.55±2.83## 27.56±1.78##

    表2 小鼠飼料消耗量的變化情況(g﹒kg-1﹒d-1, ±S)

    表2 小鼠飼料消耗量的變化情況(g﹒kg-1﹒d-1, ±S)

    注:同上

    組別 劑量g生藥﹒kg-1﹒d-1 給藥前1天 給藥后第1天 給藥后第7天 給藥后第14天空白對(duì)照組 —— 216.06±7.64 169.54±36.97 157.78±10.14## 157.93±8.53##理氣散結(jié)浸膏組 97.46 222.10±11.83 145.82±21.99## 177.16±23.44# 152.74±8.12##

    2.2.2 大鼠 與給藥前一天比較,給藥后第1天,大鼠的飼料消耗量顯著降低(P<0.05),給藥后第7、14天,各組大鼠體重有十分顯著地差異(P<0.01);與空白對(duì)照組比較,給藥后第1天,大鼠的飼料消耗量顯著降低(P<0.05),詳見表3、表4。

    表3 大鼠體重的變化情況(g, ±S)

    表3 大鼠體重的變化情況(g, ±S)

    注:同上

    組別 劑量g生藥﹒kg-1﹒d-1 給藥前1天 給藥后第1天 給藥后第7天 給藥后第14天空白對(duì)照組(n=20) —— 215.77±6.41 216.07±5.12 233.16±8.74## 246.96±8.67##理氣散結(jié)浸膏組(n=20) 48.73 212.44±5.02 213.91±5.17 228.54±9.18## 242.70±12.89##

    表4 大鼠飼料消耗量的變化情況(g﹒kg-1﹒d-1, ±S)

    表4 大鼠飼料消耗量的變化情況(g﹒kg-1﹒d-1, ±S)

    注:同上

    組別 劑量g生藥﹒kg-1﹒d-1 給藥前1天 給藥后第1天 給藥后第7天 給藥后第14天空白對(duì)照組 —— 74.66±9.06 72.29±6.09 83.57±4.37 77.49±4.13理氣散結(jié)浸膏組 48.73 75.93±9.92 51.76±5.53#** 83.75±3.16 74.17±2.65

    2.3 血常規(guī)

    2.3.1 小鼠 與空白對(duì)照組比較,理氣散結(jié)浸膏經(jīng)口一次性灌胃給予小鼠后14天,動(dòng)物血紅蛋白(HGB)、紅細(xì)胞比積(HCT)、平均紅細(xì)胞體積(MCV)和平均血小板體積(MPV)差異顯著(P<0.05),但其變化均在正常范圍內(nèi);其余各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05),詳見表5、表6。

    表5 小鼠的血常規(guī)測(cè)定結(jié)果(±S)

    表5 小鼠的血常規(guī)測(cè)定結(jié)果(±S)

    注:與空白對(duì)照組比較,* P<0.05,** P<0.01

    血紅蛋白含量g﹒L-1指標(biāo) 名稱 紅細(xì)胞數(shù)×1012/L紅細(xì)胞比積L/L平均紅細(xì)胞體積Fl平均血紅蛋白含量Pg平均血紅蛋白濃度g﹒L-1空白對(duì)照組 n=10 5.59±0.48 117.90±10.08 0.25±0.02 45.43±1.42 20.01±0.98 463.50±16.03理氣散結(jié)浸膏組 n=10 5.27±0.37 109.60±5.87* 0.23±0.02* 44.26±0.66* 19.70±0.61 468.70±14.32續(xù)表5中間細(xì)胞絕對(duì)值109/L空白對(duì)照組 n=10 18.30±0.39 60.77±33.72 350.60±121.13 7.11±0.14 6.09±1.58 3.80±0.88 0.44±0.10理氣散結(jié)浸膏組 n=10 18.47±0.38 76.68±14.83 390.10±77.86 6.95±0.10** 5.39±0.87 3.41±0.58 0.44±0.07指標(biāo) 名稱 紅細(xì)胞寬度變異系數(shù)%紅細(xì)胞寬度標(biāo)準(zhǔn)差fL血小板數(shù)109/L平均血小板體積fL白細(xì)胞數(shù)109/L淋巴細(xì)胞絕對(duì)值109/L續(xù)表5血小板分布寬度%空白對(duì)照組 n=10 1.84±0.67 63.09±4.30 7.11±0.71 29.80±4.69 0.25±0.08 15.02±3.15理氣散結(jié)浸膏組 n=10 1.56±0.35 63.48±3.89 7.65±0.50 28.87±3.92 0.27±0.06 13.34±2.40指標(biāo) 名稱 粒細(xì)胞絕對(duì)值109/L淋巴細(xì)胞百分比%中間細(xì)胞百分比%粒細(xì)胞百分比%血小板比積%

    2.3.2 大鼠 與空白對(duì)照組比較,理氣散結(jié)浸膏經(jīng)口分兩次灌胃給予大鼠后14天,各項(xiàng)血常規(guī)指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05),詳見表6。

    表6 大鼠的血常規(guī)測(cè)定結(jié)果(±S)

    表6 大鼠的血常規(guī)測(cè)定結(jié)果(±S)

    注:與空白對(duì)照組比較,* P<0.05,** P<0.01

    血紅蛋白含量g﹒L-1指標(biāo) 名稱 紅細(xì)胞數(shù)1012/L紅細(xì)胞比積L/L平均紅細(xì)胞體積Fl平均血紅蛋白含量Pg平均血紅蛋白濃度g﹒L-1空白對(duì)照組 n=20 5.04±0.28 123.65±4.28 0.24±0.01 48.03±0.86 23.25±0.90 509.55±14.08理氣散結(jié)浸膏組 n=19 5.03±0.33 124.21±4.18 0.24±0.01 48.27±1.50 23.47±1.27 511.58±22.29續(xù)表6淋巴細(xì)胞絕對(duì)值109/L空白對(duì)照組 n=20 17.75±0.35 49.62±12.10 335.45±108.00 7.34±0.10 12.44±2.09 7.98±0.96理氣散結(jié)浸膏組 n=19 17.98±0.46 50.55±13.72 322.95±130.56 7.36±0.14 11.96±2.07 7.59±1.77指標(biāo) 名稱 紅細(xì)胞寬度變異系數(shù)%紅細(xì)胞寬度標(biāo)準(zhǔn)差fL血小板數(shù)109/L平均血小板體積fL白細(xì)胞數(shù)109/L續(xù)表6血小板分布寬度%空白對(duì)照組 n=20 0.86±0.15 3.52±1.42 64.94±7.65 7.02±0.54 29.55±11.06 0.25±0.08 19.07±1.51理氣散結(jié)浸膏組 n=19 0.87±0.19 3.50±1.02 63.11±7.88 7.22±0.92 29.67±8.63 0.24±0.10 19.94±2.00指標(biāo) 名稱 中間細(xì)胞絕對(duì)值109/L粒細(xì)胞絕對(duì)值109/L淋巴細(xì)胞百分比%中間細(xì)胞百分比%粒細(xì)胞百分比%血小板比積L﹒L-1

    2.4 血液生化學(xué)

    2.4.1 小鼠 與空白對(duì)照組比較,理氣散結(jié)浸膏經(jīng)口一次性灌胃給予小鼠后14天,動(dòng)物血清中膽固醇(TC)含量顯著降低(P<0.05),但其變化值在正常范圍內(nèi);其余各項(xiàng)血液生化學(xué)指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05),詳見表7。

    表7 小鼠的血液生化學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(±S)

    表7 小鼠的血液生化學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(±S)

    注:與空白對(duì)照組比較,* P<0.05,** P<0.01

    甘油三酯mmol﹒L-1空白對(duì)照組 n=10 82.50±10.51 157.10±27.87 8.62±1.43 1.45±0.13 0.83±0.08理氣散結(jié)浸膏組 n=10 81.40±11.38 150.40±18.23 7.46±1.50 1.24±0.13** 0.84±0.10指標(biāo) 名稱 谷丙轉(zhuǎn)氨酶u﹒L-1谷草轉(zhuǎn)氨酶u﹒L-1總紅膽素umol﹒L-1膽固醇mmol﹒L-1續(xù)表7葡萄糖mmol﹒L-1空白對(duì)照組 n=10 73.87±3.81 23.61±1.53 50.26±4.70 0.48±0.06 6.74±0.73理氣散結(jié)浸膏組 n=10 73.04±3.34 23.12±2.91 49.92±2.27 0.46±0.07 6.60±0.75指標(biāo) 名稱 總蛋白g﹒L-1白蛋白g﹒L-1球蛋白g﹒L-1白球比——

    2.4.2 大鼠 與空白對(duì)照組比較,理氣散結(jié)浸膏經(jīng)口分兩次灌胃給予大鼠后14天,動(dòng)物血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)和葡萄糖(GLU)差異顯著(P<0.05),但變化均在正常范圍內(nèi);其余各項(xiàng)血液生化學(xué)指標(biāo)均無顯著性差異(P>0.05),詳見表8。

    表8 大鼠的血液生化學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(±S)

    表8 大鼠的血液生化學(xué)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果(±S)

    注:與空白對(duì)照組比較,* P<0.05,** P<0.01

    谷草轉(zhuǎn)氨酶u﹒L-1指標(biāo) 名稱 谷丙轉(zhuǎn)氨酶u﹒L-1堿性磷酸酶u﹒L-1谷氨酰轉(zhuǎn)移酶u﹒L-1總紅膽素umol﹒L-1總蛋白g﹒L-1白蛋白g﹒L-1空白對(duì)照組 n=20 56.50±8.29 132.45±25.76 170.30±54.81 11.50±2.86 6.69±2.99 60.63±8.53 24.44±1.33理氣散結(jié)浸膏組 n=19 44.84±7.41** 149.21±22.55* 139.89±49.41 10.37±3.32 7.62±3.34 62.75±7.94 24.01±1.60續(xù)表8白球比——指標(biāo) 名稱 球蛋白g﹒L-1尿素氮mmol﹒L-1肌酐umol﹒L-1膽固醇mmol﹒L-1甘油三酯mmol﹒L-1肌酸激酶u﹒L-1葡萄糖mmol﹒L-1空白對(duì)照組 n=20 36.19±8.76 0.72±0.21 5.10±2.16 83.40±27.18 1.26±0.33 0.64±0.24 145.75±49.62 8.75±2.73理氣散結(jié)浸膏組 n=19 38.74±8.27 0.65±0.15 6.39±1.93 84.11±18.35 1.28±0.29 0.80±0.41 178.58±76.06 7.18±1.47*

    3 討論

    本次急性毒性實(shí)驗(yàn)小鼠和大鼠經(jīng)口灌胃給予理氣散結(jié)浸膏的最大劑量分別為97.46 g生藥/(kg﹒d)和48.73 g生藥/(kg﹒d),相當(dāng)于成人臨床日用劑量0.3914 g生藥/(kg﹒d)的249倍和124倍,根據(jù)《中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則》進(jìn)行MTD法的測(cè)定,采用小鼠最大耐受藥量倍數(shù)計(jì)算,以耐受人臨床用量的100倍以上為安全[2]。且實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在此劑量下給藥后,均未見動(dòng)物死亡、中毒癥狀、臟器、體重和飼料消耗量等異常變化,血常規(guī)和血液生化學(xué)指標(biāo)的變化也都在正常范圍內(nèi),說明組方中山慈菇和蜂房在經(jīng)過炮制加工之后,其毒性降低到了較為安全的范圍。綜上可得,理氣散結(jié)浸膏整體毒性較低,無明顯急性毒性。本結(jié)果可為長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)和主要藥效學(xué)研究中的劑量設(shè)置提供依據(jù)。

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