校正因子法測定血塞通片中5種皂苷類成分的含量

張 艷

（江蘇省淮安市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 淮安 223300）

血塞通片由三七總皂苷加適量輔料制成，用于活血祛瘀，通脈活絡(luò)，抑制血小板聚集和增加腦血流量。用于腦路瘀阻，中風(fēng)偏癱，心脈瘀阻，胸痹心痛；腦血管病后遺癥，冠心病、心絞痛屬上述癥候者[1]。三七總皂苷含有人參皂昔Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rh，三七皂昔Rl、R2、R3、R4、R6等20多種皂苷成分[2]，其中以三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd含量最高。現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)基本都是用三七總皂苷標(biāo)準(zhǔn)品為對照品，利用5%香蘭醛冰醋酸溶液、高氯酸與其顯色后測定吸光度的方法[3]，測定樣品中三七總皂苷的含量，實(shí)驗(yàn)過程復(fù)雜，準(zhǔn)確度沒有HPLC法高。本試驗(yàn)用高效液相色譜，利用校正因子法[4]，同時測定血塞通片中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd的含量，為血塞通片的質(zhì)量控制建立一種高效準(zhǔn)確的檢測方法。

1 儀器與試藥

儀器：戴安U3000高效液相色譜儀；安捷倫Agilent 1260高效液相色譜儀；XS205型電子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO）。

試藥：三七皂苷R 1（中檢院，批號：110745-201318）；人參皂苷Rg1（中檢院，批號：110703-201731）；人參皂苷Re（中檢所，批號：110754-201626）；人參皂苷Rb1（中檢所，批號：110704-201424）；人參皂苷Rd（中檢所，批號：111818-201302）。

樣品：分別由A、B、C、D、E五家企業(yè)生產(chǎn)。

試劑：甲醇、乙腈（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）

2 方法與結(jié)果

2.1 一般方法學(xué)考察

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性

Welch Ultimate PG-C18（250 mm×4.60 mm，5 μm）和Phenomenex Gemini-NX，C18（250 mm×4.60 mm，5 μm）；檢測波長：203 nm；流動相：乙腈-水（按表1梯度洗脫，）；柱溫35℃，流速1.2 ml/min。見表1。

2.1.2 對照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取適量三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd對照品，加適量甲醇溶解，制成濃度為0.15 mg/mL的溶液，即得。

表1 梯度洗脫表

2.1.3 供試品溶液的制備

取血塞通片樣品，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于三七總皂苷25 mg），置50 mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲30 min，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 線性試驗(yàn)

精密吸取三七皂苷R1等上述五種皂苷的對照品溶液，按照2.1.1項下的色譜條件分別進(jìn)樣0.5 μL、1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL，25 μL記錄峰面積。以含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程分別為三七皂苷R1：Y=244.33x+2.149，R2=0.9998；人參皂苷Rg1：Y=367.32x-5.2452，R2=0.9999；人參皂苷Re：Y=300.08x-4.0476，R2=1；人參皂苷Rb1：Y=254.65x-2.9866，R2=1；人參皂苷Rd：Y=288.28x-49994，R2=0.9999。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd分別在0.0893～4.465 μg、0.0807～4.115 μg、0.0774～3.872 μg、0.0836～4.181 μg、0.0817～4.086 μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取三七皂苷R1等上述五種皂苷的對照品溶液，按2.1.1項下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄峰面積，計算得到峰面積的RSD分別為0.5%、0.2%、0.3%、0.2%、0.4%。結(jié)果表明儀器精密度符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取三七皂苷R1等上述五種皂苷的對照品溶液，按2.1.1項下的色譜條件，在0、1、6、8、12、24、48、72 h分別進(jìn)樣，每次10 μl，記錄峰面積，計算得到峰面積的RSD分別為0.11%、0.14%、0.27%、0.10%、0.15%。結(jié)果表明五種對照品溶液在72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 加樣回收率試驗(yàn)

稱取樣品A粉末0.1 g，置50 mL量瓶中，加甲醇適量，分別精密加入三七皂苷R1等上述五種皂苷的對照品各適量，超聲30 min，加甲醇至刻度，搖勻，取續(xù)濾液。按照2.1.1項下的色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積，平行操作6份。計算得到五者的加樣回收率，三七皂苷R1：99.5%、100.2%、100.2%、97.5%、99.6%、99.3%、平均99.4%，RSD%為1.0%；人參皂苷Re：99.1%、98.7%、97.5%、99.1%、99.1%、100.0%、平均98.9%，RSD%為0.9%；人參皂苷Rg1：97.9%、100.2%、100.6%、99.5%、99.7%、98.9%、平均99.4%，RSD%為1.0%；人參皂苷Rb1：97.5%、100.0%、97.3%、100.3%、100.2%、100.4%、平均99.3%，RSD%為1.8%；人參皂苷Rd：99.4%、98.3%、101.8%、100.5%、100.7%、97.6%、平均99.7%，RSD%為1.6%。結(jié)果可以看出加樣回收率試驗(yàn)符合要求。

2.2 校正因子的重復(fù)性考察

2.2.1 高效液相色譜儀的考察

取2.1.2項下的對照品溶液，選擇不同的色譜系統(tǒng)，按2.1.1項下的色譜條件分別進(jìn)樣2、5、10、20、25 μl測定，以人參皂苷Rg1為內(nèi)標(biāo)，計算校正因子，見表2。

2.2.2 待測組分色譜峰的定位

取對照品溶液、樣品A～E，按2.1.3項下的方法處理，分別選擇不同的高效液相色譜儀按2.1.1項下的色譜條件進(jìn)樣，以人參皂苷Rg1為內(nèi)標(biāo)，記錄各色譜峰的保留時間。計算相對保留時間見表3。由結(jié)果可以看出，利用相對保留時間來定位峰是可行的。

2.3 校正因子法與外標(biāo)法結(jié)果比較分析

取樣品A～E5個樣品，按2.1.3項下的方法處理，按2.1.1項下的色譜條件進(jìn)樣。采用校正因子法和外標(biāo)法計算樣品中四種皂苷的含量，結(jié)果見表4、5。對四種皂苷不同方法、不同儀器所測得的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果無顯著性差異，表明校正因子法是切實(shí)可行的。

表2 不同色譜系統(tǒng)得到的相對校正因子

表3 相對保留時間結(jié)果

表4 校正因子法與外標(biāo)法測定結(jié)果比較1

表5 校正因子法與外標(biāo)法測定結(jié)果比較2

3 討 論

參考文獻(xiàn)[5]，確定測定波長為203 nm，選用乙腈-水梯度洗脫系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)峰形良好，人參皂苷Rg1與人參皂苷Re的分離度符合有關(guān)技術(shù)要求。

以相對保留時間來進(jìn)行色譜峰的定位，考察了Agilent 1260和戴安U3000兩種不同高效液相色譜系統(tǒng)的影響，建立了校正因子法測定血塞通片中皂苷類成分的檢測方法，比較校正因子法和外標(biāo)法測定含量結(jié)果的差別。結(jié)果表明，校正因子法與外標(biāo)法得到的含量值之間沒有顯著性差異，說明采用校正因子法測定血塞通片中皂苷類成分的方法是可行的。

利用校正因子的方法測定血塞通片中5種皂苷的含量，在原有標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上提高了檢測的準(zhǔn)確性，校正因子的運(yùn)用還可以大大節(jié)約檢驗(yàn)成本。