β—羥基—β—甲基丁酸對(duì)衰老小鼠腓腸肌蛋白質(zhì)合成的影響研究

尤莉蓉 趙艷 尚畫雨 孟思進(jìn) 史仍飛 夏志

摘 要：探索膳食添加β-羥基-β-甲基丁酸（HMβ）對(duì)衰老小鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)理。方法：16月齡雄性C57BL/6J小鼠24只隨機(jī)納入3個(gè)處理組：膳食添加HMβ組、添加等氮?jiǎng)┝勘彼峤M及空白對(duì)照組，其中HMβ組小鼠和丙氨酸組小鼠飼料中分別添加4.5% HMβ和3.4%丙氨酸，空白對(duì)照組則飼以國家標(biāo)準(zhǔn)維持飼料，共計(jì)干預(yù)8周。期間記錄各組小鼠體質(zhì)量與采食量，測(cè)量小鼠后肢的最大抓握力。各組小鼠于末次飼食后禁食12 h，麻醉后摘眼球采血處死，移除腓腸肌外側(cè)頭淺層白肌并稱重。測(cè)定骨骼肌蛋白質(zhì)總量、肌原纖維與肌漿蛋白含量且免疫印跡檢測(cè)MHCⅡ、mTORSer2448、p70s6kThr389和4EBP1Thr37/46磷酸化表達(dá)的組間差異。結(jié)果：膳食添加4.5%劑量的HMβ未顯著影響衰老小鼠體重與采食量，但可見腓腸白肌濕重、濕重/體重校正比值增加，且增幅具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；腓腸白肌蛋白質(zhì)總量、肌原纖維與肌漿蛋白質(zhì)含量及MHCⅡ總量表達(dá)均顯著增長；mTORSer2448、p70s6kThr389與4EBP1Thr37/46磷酸化水平亦有明顯上調(diào)。結(jié)論：膳食添加4.5%比例HMβ具有促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)合成，削弱衰老性骨骼肌萎縮與功能衰退的重要潛力，其作用機(jī)理可能涉及mTOR/p70s6k/4EBP1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化。

關(guān)鍵詞：β-羥基-β-甲基丁酸；肌少癥；蛋白質(zhì)合成；功能衰退；哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白

中圖分類號(hào)：G 804.7 學(xué)科代碼：040302 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract：Objective： To investigate the effects of beta-hydroxy-beta-methylbutyrate （HMβ） supplementation on protein synthesis in aged mice and preliminarily explore the possible mechanism of action. Method： Twenty four C57BL/6J male mouse， 16-month old， were randomly allocated to three groups： HMβ supplementation， isonitrogenous alanine supplementation and blank control group. Mice in HMβ and alanine group were treated with standard chow diet supplemented with 4.5% HMβ and 3.4% alanine respectively for 8 weeks， while blank control group were fed with normal diet. Both body weight and food intake were recorded during research， the maximal grip strength of lateral limb was also determined. Twelve hours of fasting after the last feeding， mice exposed to anesthesia and then sacrificed via drawing blood. The white gastrocnemius muscle was removed and weighed. The total protein， myofibrillar and sarcoplasmic protein content in white gastrocnemius were determined， and the phosphorylation of mTORSer2448， p70s6kThr389and 4EBP1Thr37/46 was also measured using western blotting. Results： Both body weight and food intake of aged mice were not significantly influenced by dietary HMβ supplementation. The wet weight of white gastrocnemius， and re-adjusted ratio of white gastrocnemius to body weight were significantly improved. The total protein， myofibrillar and sarcoplasmic protein content， and expression of MHCⅡ were greatly increased. Furthermore， the phosphorylation rate of mTORSer2448，p70s6kThr389 and 4EBP1Thr37/46 were also found to be elevated significantly. Conclusion： Dietary HMβ supplementation with 4.5% dosage was capable of promoting muscular protein synthesis， and thus it has the potential to attenuate age-related skeletal muscle atrophy and functional decline. In terms of the possible mechanism， the mTOR/p70s6k/4EBP1 signaling pathway may be directly or at least to some extent involved in this process.

Keywords：HMβ；sarcopenia； protein synthesis； functional decline； mTOR

肌少癥（sarcopenia，SP）是一種隨年齡增長而出現(xiàn)的骨骼肌病理性變化，主要表現(xiàn)為骨骼肌量的進(jìn)行性減少與功能衰退，在老齡人群中其發(fā)生率可超過30%[1]。SP過程中快縮型骨骼肌萎縮性變化明顯，患者生活質(zhì)量與身心健康多受到嚴(yán)重影響，可能因此而出現(xiàn)摔倒、殘疾等意外傷害甚至導(dǎo)致死亡，是老齡人群所面臨的重要威脅之一。隨著我國社會(huì)老齡化進(jìn)程的不斷發(fā)展，老齡人口日益增長，SP的發(fā)生、發(fā)展與患者醫(yī)療費(fèi)用的增長直接相關(guān)，目前SP已成為影響健康老齡化的重大社會(huì)問題，對(duì)我國公共醫(yī)療開支與社會(huì)經(jīng)濟(jì)也形成了較為沉重的負(fù)擔(dān)[2]；因此，加強(qiáng)對(duì)SP干預(yù)措施的研究，制訂合理且有針對(duì)性的干預(yù)方案，對(duì)于改善老齡人群骨骼肌功能狀態(tài)，促進(jìn)健康老齡化目標(biāo)的順利實(shí)現(xiàn)具有重要意義。

蛋白質(zhì)代謝平衡的紊亂是誘發(fā)骨骼肌萎縮的根本原因[3]，就SP而言則主要因蛋白質(zhì)合成的減少所致[4]。亮氨酸被認(rèn)為是骨骼肌蛋白質(zhì)合成的有力營養(yǎng)刺激，已有此前的相關(guān)研究也證實(shí)以5%比例進(jìn)行膳食亮氨酸添加可有效促進(jìn)老齡小鼠骨骼肌蛋白質(zhì)合成，抑制衰老所致骨骼肌萎縮[5-7]；但近期有個(gè)別研究認(rèn)為，亮氨酸代謝中間產(chǎn)物β-羥基-β-甲基丁酸（β-hydroxy-β-methylbutyrate，HMβ）可能更適于作為干預(yù)SP的營養(yǎng)手段。其原因有二：一方面，HMβ與亮氨酸相比能以更低的劑量產(chǎn)生更顯著的促蛋白質(zhì)正性平衡作用[8]；另一方面，以高劑量進(jìn)行亮氨酸補(bǔ)充可能促進(jìn)腫瘤生長，從而限制了其在惡性腫瘤高危老年人群中的應(yīng)用[9]。就HMβ而言，目前學(xué)界多認(rèn)為其對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)作用主要集中于削弱降解方面的潛力；因此，對(duì)于惡病質(zhì)與長期臥床等消耗狀態(tài)下的骨骼肌萎縮可能具有較好的干預(yù)效果，但其究竟能否通過促進(jìn)衰老骨骼肌蛋白質(zhì)合成而發(fā)揮保護(hù)作用，迄今仍無定論。鑒于此，本研究擬在前期關(guān)于亮氨酸的研究基礎(chǔ)上，觀察膳食添加等氮?jiǎng)┝縃Mβ對(duì)衰老小鼠快縮型骨骼肌蛋白質(zhì)合成與肌力的影響，評(píng)價(jià)其在預(yù)防衰老性骨骼肌萎縮和功能衰退方面的潛力，并通過觀察調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵信號(hào)通路的表達(dá)變化，初步探討HMβ可能的作用原理。

1 研究方法

1.1 實(shí)驗(yàn)法

1）實(shí)驗(yàn)對(duì)象及分組。16月齡C57BL/6J雄性小鼠24只，體質(zhì)量（48.6±0.9） g，由南京鵬晟生物有限公司提供。單籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，室溫（22±1.5） ℃，光照12 h。區(qū)間分組法據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)納入空白對(duì)照組（N）、膳食添加丙氨酸對(duì)照組（A）與膳食添加HMβ組（H），每組8只。

2）飼料配制。已有研究表明，5%亮氨酸可有效促進(jìn)骨骼肌蛋白質(zhì)正性平衡，對(duì)于衰老骨骼肌具有積極的保護(hù)作用[5-7]。本研究中采用與5%亮氨酸等氮?jiǎng)┝康腍Mβ（純度95%）來添加。具體方法為：以普通國標(biāo)維持飼料為底料，沿襲替換等量玉米粉的方法，在H組小鼠飼料內(nèi)添加4.5%比例HMβ，A組小鼠飼料中仍添加3.4%非必需氨基酸丙氨酸，配為等氮對(duì)照飼料，以使各組飼料的粗蛋白基本一致。H組飼料的消化能、粗蛋白、鈣、總磷與有效磷含量分別為14.57 MJ/kg、24.3%（質(zhì)量比）、1.26%（質(zhì)量比）、1.15%（質(zhì)量比）與0.91%（質(zhì)量比），氨基酸檢測(cè)如圖1所示。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料的氨基酸含量見表1。

3）實(shí)驗(yàn)方案。參考已有研究方法[5-7]，N組小鼠飼喂底料，H組飼喂HMβ添加料，A組飼喂添加丙氨酸的等氮飼料，每周稱量3次并記錄采食量，干預(yù)8周后處死取材。

4）主要儀器與試劑。主要儀器：美國Thermo MultiSkan3型酶標(biāo)儀、美國Bio-Rad電泳儀、北京凱元Mini P-4電泳槽、濟(jì)南益延科技YLS-13A大小鼠抓握力計(jì)。主要試劑：常規(guī)試劑均購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心或國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。食品級(jí)HMβ購自靖江市三益化工有限公司，丙氨酸購自上海生工公司（AD0022）。蛋白提取試劑與蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司（78510、23235或23200），蛋白酶抑制劑購自瑞士Roche公司（11836153001），mTOR總量與Ser2448位點(diǎn)磷酸化一抗（5536S、2983S）、p70s6k總量與Thr389位點(diǎn)磷酸化一抗（2708S、9234S）、4EBP1總量與Thr37/46位點(diǎn)磷酸化一抗（2855S、9644S）購自北京賽信通公司，Ⅱ肌球蛋白重鏈（MHCⅡ）總量抗體一抗（Ab51263）購自上海艾博抗公司，HRP標(biāo)記二抗購自美國Jackson公司（115-035-003、111-035-003），蛋白Marker購自立陶宛Fermentas公司（SM6210）。

5）取材。各組小鼠在取材前禁食過夜，飲水不限。取材日0.3 mL/（100 g ）劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉后摘眼球采血。常規(guī)分離血清與血漿后分裝保存待測(cè)。快速分離腓腸肌外側(cè)頭白肌，液氮速凍后置超低溫冰箱保存待測(cè)。

6） 測(cè)試方法。

①肌原纖維與肌漿蛋白定量。肌原纖維與肌漿蛋白含量測(cè)定參考Koopman等[10]的研究，肌樣在5%預(yù)冷緩沖液（0.25 mol/L蔗糖、2 mmol/L EDTA與10 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl）中勻漿后600g離心20 min，收集含肌原纖維蛋白的沉降物，上清于4 ℃ 100 000g離心60 min分離肌漿蛋白。采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量：吸取0、0.01、0.02、0.04和0.05 mL 1 mg/mL BSA于比色管內(nèi)，加入0.1、0.09、0.08、0.06、0.04、0.02和0 mL生理鹽水后加入5 mL考馬斯亮藍(lán)，混勻靜置20 min，595 nm波長測(cè)定OD值。循此法取0.01 mL蛋白樣本與0.09 mL生理鹽水及等量考馬斯亮藍(lán)混勻靜置后測(cè)定OD值。據(jù)OD值計(jì)算蛋白含量。

②蛋白表達(dá)分析。Western blotting測(cè)定蛋白表達(dá)，方法同已有研究[5-7]：肌樣加入蛋白提取試劑后剪成1～2 mm3碎粒并勻漿，4 ℃ 10 000g離心20 min后取上清。蛋白定量后以每次上樣120 μg的標(biāo)準(zhǔn)分裝，PBS補(bǔ)足20 μL。加入5X上樣緩沖液5 μL后煮沸變性。配制5%濃縮膠與15%分離膠，濃縮膠80 V恒壓30～40 min，分離膠120 V恒壓，溴酚藍(lán)至板底后停止。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，恒流300 mA，MHCⅡ表達(dá)的轉(zhuǎn)膜2.5 h，稀釋比1∶3 000；mTOR表達(dá)轉(zhuǎn)膜2 h，稀釋比均為1∶1 000；p70s6k表達(dá)轉(zhuǎn)膜1 h，總量與磷酸化表達(dá)稀釋比分別為1∶2 000與1∶500；4EBP1表達(dá)轉(zhuǎn)膜0.5 h，稀釋比均為1∶1 000。

③肌肉功能評(píng)價(jià)。采用小鼠后肢抓握力評(píng)價(jià)骨骼肌功能。根據(jù)已有的經(jīng)驗(yàn)，16月齡小鼠每周肌力變化并不顯著，因此，本研究中在正式干預(yù)前測(cè)定基礎(chǔ)值，此后每2周重復(fù)測(cè)量一次。測(cè)試時(shí)用靜脈輸液管套住小鼠前爪使其不能抓握，提起鼠尾使其后肢抓緊測(cè)力板金屬抓握桿，緩慢水平向后拉動(dòng)，雙側(cè)后肢若同時(shí)松開則記錄顯示器數(shù)值。每只小鼠視測(cè)試表現(xiàn)重復(fù)6～10次，以最大值為準(zhǔn)。

1.2 數(shù)理統(tǒng)計(jì)法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。體質(zhì)量與平均采食量指標(biāo)采用Repeated measures ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，不滿足球?qū)ΨQ時(shí)，參照Greenhouse-Geisse校正結(jié)果。對(duì)各組動(dòng)物組內(nèi)各時(shí)點(diǎn)值進(jìn)行多重比較時(shí)，若校正系數(shù)Epsilon<0.7時(shí)采用Bonferroni法進(jìn)行置信區(qū)間校正。其他指標(biāo)均采用One-way ANOVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間多重比較也參照Bonferroni校正的結(jié)果。P≤0.05時(shí)，認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 體質(zhì)量

實(shí)驗(yàn)期內(nèi)小鼠體質(zhì)量變化如圖2所示。重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示：球形檢驗(yàn)P<0.01，不滿足球?qū)ΨQ，需采用校正后結(jié)果進(jìn)行判斷。其中時(shí)間因素的主效應(yīng)顯著（F=15.736，P<0.01），提示各組小鼠體質(zhì)量在實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)均具有隨時(shí)間而變化的趨勢(shì)；組內(nèi)各時(shí)點(diǎn)間多重比較的Bonferroni校正結(jié)果表明N組與H組小鼠各時(shí)點(diǎn)體質(zhì)量未見顯著差異，僅N組小鼠第4、7、8周體質(zhì)量較第2周有顯著升高，P值分別為0.038、0.021、0.029。分組因素（F=2.076，P=0.151）與交互效應(yīng)（time×group，F(xiàn)=0.962，P=0.453）均未具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示不同處理未導(dǎo)致各組小鼠體質(zhì)量產(chǎn)生具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異，各時(shí)點(diǎn)組間多重比較結(jié)果亦未見顯著差異。

2.2 采食量

實(shí)驗(yàn)期內(nèi)小鼠采食量變化如圖3所示。重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示：球形檢驗(yàn)P=0.032，采用校正后結(jié)果判斷。時(shí)間（F=0.1761，P=0.130）、分組（F=0.794，P=0.465）因素的主效應(yīng)及兩因素的交互效應(yīng)（F=0.399，P=0.966）均未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示各組小鼠平均采食量在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)未見顯著變化，不同處理也未對(duì)其采食量造成明顯影響。組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)多重比較與組間各時(shí)點(diǎn)采食量多重比較結(jié)果也未見具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異。

2.3 處死前體質(zhì)量與腓腸白肌重

如圖4A所示，單因素方差分析結(jié)果顯示各組小鼠處死前體質(zhì)量組間差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.428，P=0.262）。如圖4B所示，腓腸白肌濕重組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=3.332，P=0.050），組間多重比較結(jié)果也表明H組（157.8±10.4）小鼠腓腸白肌濕重顯著高于N組（149.0±8.4）與A組（147.9±5.6），P值分別為0.049與0.028。腓腸白肌濕重與體質(zhì)量比值如圖4C所示，方差分析結(jié)果表明組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4.354，P=0.026），多重比較結(jié)果也顯示H組（0.33±0.019）比值顯著高于N組（0.30±0.023）與A組（0.31±0.016），P值分別為0.010與0.047。

2.4 骨骼肌蛋白質(zhì)總量、肌原纖維與肌漿蛋白質(zhì)含量

如圖5A所示，腓腸白肌蛋白總量組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=7.206，P=0.004），組間多重比較結(jié)果也表明H組（43.3±2.2）小鼠蛋白總量顯著高于N組（38.5±3.7）與A組（39.0±2.2），P值分別為0.007與0.017。如圖5B所示，肌原纖維蛋白含量組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=19.655，P=0.000），組間多重比較結(jié)果也表明H組（39.8±1.4）小鼠蛋白總量顯著高于N組（32.8±2.5）與A組（32.1±3.8），P值均為0.000。肌漿蛋白含量如圖5C所示，H組（35.3±2.8）含量顯著高于N組（30.1±2.2）與A組（30.5±1.4），P值均為0.001。

2.5 肌力

實(shí)驗(yàn)期內(nèi)小鼠抓握力變化如圖6所示。重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示：球形檢驗(yàn)P=0.000，采用校正后結(jié)果判斷。除分組因素之外（F=0.128，P=0.880），時(shí)間（F=23.347，P=0.000）因素的主效應(yīng)及兩因素的交互效應(yīng)（F=65.545，P=0.000）均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示各組小鼠的抓握力量在整個(gè)實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)具有顯著變化，但不同處理也未導(dǎo)致顯著的組間差異。然而，對(duì)不同時(shí)點(diǎn)各組間組小鼠抓握力進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，第8周時(shí)H組小鼠肌力（126.6±14.4）與N組（115.4±13.9）與A組（116.7±10.6）的差異接近臨界P值，分別為0.054與0.062。對(duì)各組小鼠不同時(shí)點(diǎn)抓握力的縱向比較發(fā)現(xiàn)，較初始值而言，N組（P=0.018，P=0.000）與A組（P=0.012，P=0.000）小鼠第6、8周肌力顯著降低，而H組則表現(xiàn)為增強(qiáng)（P=0.036，P=0.003）。

2.6 促蛋白質(zhì)合成信號(hào)通路蛋白表達(dá)

如圖7A所示，H組（1.94±0.27）小鼠mTORSer2448磷酸化率較N組與A組上調(diào)，P值均為0.001，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；如圖7B所示，H組（2.20±0.44）p70s6kThr389磷酸化率同樣較N組與A組小鼠上調(diào)，P值均為0.002，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；如圖7C所示，H組（2.01±0.37）4EBP1Thr37/46磷酸化水平較2個(gè)對(duì)照組升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.002）；就MHCⅡ（2.46±0.25）蛋白表達(dá)而言，H組亦較N組與A組增高，增幅具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）。

3 討論

本研究在前期關(guān)于亮氨酸干預(yù)效果的研究基礎(chǔ)上[5-7]，使用小鼠國標(biāo)維持飼料為底料，采用等量替換玉米粉的形式，以與5%亮氨酸等氮（粗蛋白）的劑量進(jìn)行了HMβ添加，劑量經(jīng)等氮換算為4.5%。就對(duì)照組而言，循常規(guī)設(shè)立了等氮對(duì)照組與空白對(duì)照組，其中等氮組同樣采用了3.4%比例的α-丙氨酸添加。α-丙氨酸作為一種可以快速代謝的非必需氨基酸，已被證實(shí)不影響骨骼肌蛋白質(zhì)合成，常作為氨基酸營養(yǎng)研究中的等氮處理手段[6]。通過本研究的實(shí)驗(yàn)組飼料氨基酸檢測(cè)結(jié)果可見，飼料配制是完全滿足本研究需要的。而關(guān)于研究期內(nèi)體質(zhì)量與平均每日采食量的變化結(jié)果也表明，以4.5%劑量添加HMβ并未顯著改變小鼠正常生長性能與平均采食量，進(jìn)一步佐證了以國標(biāo)維持料作為底料進(jìn)行的HMβ或丙氨酸添加的可取性。

衰老骨骼肌蛋白質(zhì)合成水平的變化是本研究所關(guān)注的科學(xué)問題。本研究通過骨骼肌濕質(zhì)量、骨骼肌濕質(zhì)量/終末體質(zhì)量百分比，骨骼肌蛋白質(zhì)總量、肌原纖維蛋白質(zhì)含量、肌漿蛋白質(zhì)含量，以及骨骼肌蛋白質(zhì)合成關(guān)鍵信號(hào)通路蛋白功能表達(dá)水平3個(gè)方面的適應(yīng)性變化建立評(píng)價(jià)指標(biāo)體系，分別從組織、分子和蛋白質(zhì)3個(gè)層面對(duì)不同處理手段對(duì)衰老骨骼肌蛋白質(zhì)合成代謝所造成的影響進(jìn)行了探討。就組織重量的變化而言，添加HMβ導(dǎo)致腓腸白肌濕重較對(duì)照組呈增加趨勢(shì)，且增幅具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于同月齡小鼠的骨骼肌量可能受到體質(zhì)量的直接影響，因此，采用各組小鼠處死前體質(zhì)量對(duì)腓腸白肌濕重進(jìn)行了校正，結(jié)果也觀察到了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的組間差異。提示HMβ組小鼠腓腸白肌較進(jìn)行等氮干預(yù)的丙氨酸組和空白對(duì)照組小鼠出現(xiàn)了適應(yīng)性肥大，與前人的相關(guān)研究結(jié)果一致。Gerlinger-Romero等[11]最近的一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，給成年大鼠以320 mg/kg劑量強(qiáng)飼HMβ共計(jì)28 d，可致趾長伸肌濕重較安慰劑對(duì)照大鼠出現(xiàn)顯著增長。而Vukovich等[12 ] 早期采用老年人體被試所進(jìn)行的研究也觀察到，膳食添加HMβ的被試較對(duì)照組在第8周時(shí)呈現(xiàn)出顯著的瘦體質(zhì)量增長。

由于小鼠骨骼肌量較小，而本研究中所使用的腓腸白肌僅為腓腸肌外側(cè)頭淺層白色部分；因此，在取材時(shí)難以避免的誤差可能會(huì)對(duì)本研究結(jié)果造成混雜影響。基于此進(jìn)而檢測(cè)了不同處理組中骨骼肌蛋白質(zhì)含量的差異。作為蛋白質(zhì)合成水平的直接評(píng)價(jià)指標(biāo)，骨骼肌蛋白質(zhì)總量、肌原纖維蛋白質(zhì)含量及肌漿蛋白質(zhì)含量可以更為直觀、準(zhǔn)確地揭示蛋白質(zhì)合成的變化趨勢(shì)。數(shù)據(jù)表明：無論是蛋白質(zhì)總量還是肌原纖維或肌漿蛋白質(zhì)含量，均表現(xiàn)出了顯著的組間差異，且添加HMβ組小鼠的蛋白質(zhì)水平較對(duì)照組高。在目前的參考文獻(xiàn)中，F(xiàn)lummer等[13]給仔豬飼料中添加HMβ[15 mg Ca（HMβ）2/kg]28 d發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組仔豬的蛋白質(zhì)含量顯著高于安慰劑對(duì)照動(dòng)物，也與本研究所觀察到的結(jié)果一致。骨骼肌是機(jī)體最為重要的蛋白質(zhì)存儲(chǔ)池，不僅有50%～75%的機(jī)體蛋白質(zhì)儲(chǔ)備于骨骼肌內(nèi)，且這一儲(chǔ)備直接受到骨骼肌蛋白質(zhì)合成與降解平衡的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)；因此，保持這一平衡對(duì)于預(yù)防萎縮、維護(hù)代謝健康至關(guān)重要[14]。如前所述，SP發(fā)生與發(fā)展的重要特點(diǎn)及根本原因在于蛋白質(zhì)合成量的減少，因此，腓腸肌蛋白質(zhì)總量與肌原纖維、肌漿蛋白含量的增多提示膳食添加HMβ可能具有改善SP的重要潛力。

調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白質(zhì)合成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不僅是探討各種干預(yù)手段作用機(jī)制的重要靶點(diǎn)，同時(shí)也可作為蛋白質(zhì)代謝水平的間接指示，通路中關(guān)鍵調(diào)控蛋白的功能表達(dá)變化同樣能夠反映蛋白質(zhì)合成的上調(diào)或下調(diào)趨勢(shì)。前期的研究表明，衰老骨骼肌蛋白質(zhì)合成的調(diào)節(jié)機(jī)制也以mTOR為中心，合成代謝刺激可通過mTOR介導(dǎo)直接控制翻譯的起始與延伸；因此，在蛋白質(zhì)合成調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用[5-7]。此前也有研究證實(shí)，特異性阻斷mTOR的功能表達(dá)將抑制95%的適應(yīng)性肌肉肥大[15]。mTOR下游靶蛋白在蛋白質(zhì)合成調(diào)節(jié)過程中也具有重要作用，其中p70s6k可磷酸化rPS6并進(jìn)而控制含有5-末端寡聚嘧啶的mRNAs的翻譯效率。4EBP1的磷酸化則調(diào)節(jié)eIF4F復(fù)合物的裝配，對(duì)于帽依賴性翻譯的起始具有重要作用；因此，就衰老骨骼肌蛋白質(zhì)代謝而言，mTOR/p70s6k/4EBP1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化也被視為蛋白質(zhì)合成增加的間接表現(xiàn)。本研究中觀察到，膳食添加HMβ組小鼠mTORSer2448、p70s6kThr389與4EBP1Thr37/46的蛋白質(zhì)磷酸化率較等氮與空白對(duì)照組小鼠均有顯著上調(diào)，提示該組小鼠腓腸白肌蛋白質(zhì)合成增加，且表明該通路在HMβ調(diào)節(jié)衰老骨骼肌蛋白質(zhì)合成過程中也具有重要作用。Eley等[16]對(duì)C2C12肌管細(xì)胞給予50 mM HMβ孵育，發(fā)現(xiàn)顯著刺激了細(xì)胞蛋白質(zhì)合成，這一反應(yīng)與mTOR及其下游靶蛋白4EBP1與p70s6k的磷酸化呈正性相關(guān)，且可以為mTOR抑制劑雷帕霉素所阻斷，這一結(jié)果較好地佐證了mTOR/p70s6k/4EBP1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白質(zhì)合成中的貢獻(xiàn)。但是，HMβ究竟通過何種途徑調(diào)節(jié)這一信號(hào)通路？迄今仍不清楚。就MHCⅡ蛋白表達(dá)而言，由于SP主要表現(xiàn)為快縮型骨骼肌的變化，而快縮型骨骼肌纖維類型及收縮表型由Ⅱ型相對(duì)表達(dá)所決定；因此，MHCⅡ的表達(dá)變化也對(duì)骨骼肌蛋白質(zhì)合成水平有間接指示作用。本研究中補(bǔ)充HMβ導(dǎo)致小鼠腓腸白肌內(nèi)MHCII的表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)一步反映了蛋白質(zhì)合成反應(yīng)的增強(qiáng)。

除上述骨骼肌蛋白質(zhì)合成評(píng)價(jià)指標(biāo)體系之外，肌肉力量的增長可在一定程度上反映機(jī)體同化作用的增強(qiáng)。就HMβ對(duì)肌力的影響而言，本研究觀察到膳食添加HMβ使小鼠抓握力從第4周開始呈上升趨勢(shì)，至第6周時(shí)即已表現(xiàn)出顯著的增長，而等氮與空白對(duì)照組小鼠肌力則呈相反變化趨勢(shì)，在第6周時(shí)較實(shí)驗(yàn)前有明顯下降。盡管實(shí)驗(yàn)?zāi)┐螠y(cè)試的小鼠最大抓握力仍未見顯著組間差異，但組內(nèi)縱向比較的結(jié)果仍然足以說明HMβ對(duì)衰老骨骼肌肌力的保護(hù)作用。前人探討HMβ促力作用時(shí)，肌力變化多作為一項(xiàng)重點(diǎn)關(guān)注指標(biāo)。Payne等[17]以杜氏肌肉營養(yǎng)不良模型小鼠為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充8周HMβ可增強(qiáng)小鼠抓握力并延長抓握耐力，且肌肉丟失得到緩解。Noh等[18]給經(jīng)地塞米松處理的大鼠以150或600 mg/kg劑量灌胃HMβ 5 d，發(fā)現(xiàn)肌肉丟失與握力下降均受到抑制。Park等[19]以0.5 g/kg劑量給接受能量限制（-30%）的小鼠施加HMβ干預(yù)6周，也觀察到抓握力與腓腸肌量的增長?？梢?，HMβ在多種肌肉萎縮條件下均可對(duì)肌肉質(zhì)量和肌肉力量產(chǎn)生保護(hù)作用。而Vallejo等[20]近期以19月齡小鼠為研究對(duì)象，以514 mg/kg劑量補(bǔ)充HMβ 8周，同樣發(fā)現(xiàn)肌肉功能衰退受到明顯抑制，進(jìn)一步佐證了HMβ在改善SP小鼠肌力方面的作用潛力。

就HMβ通過刺激骨骼肌蛋白質(zhì)合成改善骨骼肌萎縮與功能衰退的作用而言，相關(guān)研究結(jié)果目前仍有分歧[21]。作為亮氨酸的中間代謝產(chǎn)物，HMβ經(jīng)亮氨酸代謝生成比例僅為5%左右，既然亮氨酸的營養(yǎng)促力作用已達(dá)成共識(shí)，則關(guān)于HMβ研究結(jié)果的矛盾從理論上而言可能仍源自于干預(yù)劑量與干預(yù)周期的差異。Rossi等[22]最近研究發(fā)現(xiàn)老年人群每日需攝入高達(dá)60 g亮氨酸以滿足機(jī)體對(duì)HMβ的需求量。本研究是在前期亮氨酸相關(guān)研究的基礎(chǔ)上采用等氮?jiǎng)┝窟M(jìn)行HMβ膳食添加，而5%劑量亮氨酸被認(rèn)為有助于血漿亮氨酸達(dá)到維持骨骼肌細(xì)胞內(nèi)外最佳比例的水平，加之研究對(duì)象為自然衰老小鼠，8周干預(yù)周期相對(duì)較為充足，從而能夠產(chǎn)生積極的干預(yù)效果。從這一角度看，其應(yīng)用可能仍需要臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的深入研究。此外，基于上述線索，不難理解HMβ與亮氨酸相比為何能以較小劑量而發(fā)揮更為顯著的效果，但兩者調(diào)節(jié)衰老骨骼肌蛋白質(zhì)合成作用的異同仍有待進(jìn)一步比較予以明確。

4 結(jié)束語

以4.5%劑量膳食添加HMβ可促進(jìn)快縮型骨骼肌蛋白質(zhì)總量、肌原纖維與肌漿蛋白質(zhì)含量增多，MHCⅡ蛋白表達(dá)上調(diào)，骨骼肌濕重增長及肌肉力量增加，具有促進(jìn)衰老骨骼肌蛋白質(zhì)合成、預(yù)防和延緩衰老性骨骼肌萎縮與功能衰退的重要潛力，其作用機(jī)理可能涉及mTOR/p70s6k/4EBP1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化。但HMβ激活該通路的具體途徑即mTOR的上游調(diào)控蛋白目前仍不清楚，其較亮氨酸在調(diào)節(jié)骨骼肌蛋白質(zhì)合成方面的作用有何差異亦需明確，這些問題仍有待進(jìn)一步研究。

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