錯配修復(fù)蛋白及Kras蛋白表達在子宮內(nèi)膜病變中的意義

梁婷 梅金紅 李榮

[摘要] 目的 觀察錯配修復(fù)MMR（Mismatch Repair）及Kras蛋白在子宮內(nèi)膜病變中的表達，分析其MSI與Kras表達的意義及相關(guān)性。 方法 選取我院2014年1月～2017年12月子宮內(nèi)膜病例共108例，用全自動免疫組化儀檢測MMR及Kras。 結(jié)果 ①MMR失表達在內(nèi)膜增生不伴非典型、增生伴非典型和內(nèi)膜樣腺癌組呈遞增趨勢。MLH1、MSH2和PMS2失表達在三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），MSH6差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.189）。②內(nèi)膜癌組MSI-H及MSI-L表型比率最高，在三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。③內(nèi)膜癌組中MSI（Microsatellite instability）表型在不同年齡及腫瘤分化程度差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。④Kras在三組病例表達呈遞增趨勢，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。⑤存在MSI的病例均伴有Kras表達，同時存在MSI及Kras表達的病例數(shù)量在增生伴非典型與內(nèi)膜癌組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 ①MSI及Kras可能是內(nèi)膜癌進展的重要分子事件，與患者年齡、組織分化程度沒有明顯關(guān)系。②聯(lián)合檢測MMR及Kras蛋白可能有助于子宮內(nèi)膜病變的診斷。

[關(guān)鍵詞] 錯配修復(fù)；MSI；Kras；子宮內(nèi)膜

[中圖分類號] R737.33 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2018）22-0107-04

[Abstract] Objective To observe the expression of Mismatch Repair（MMR） and Kras protein in endometrial lesions and analyze the significance and correlation of MSI and Kras expression. Methods A total of 108 cases with endometrial lesions from January 2014 to December 2017 in our hospital were selected. MMR and Kras were detected with an automated immunohistochemical apparatus. Results ①The loss of expression of MMR in the group of intimal hyperplasia without atypical lesions， hyperplasia with atypical lesions and endometrioid adenocarcinoma showed an increasing trend. The differences of the loss of expression of MLH1， MSH2， and PMS2 were statistically significant among the three groups（P<0.05）. The difference in MSH6 was not statistically significant（P=0.189）. ②The ratio of MSI-H and MSI-L phenotype in the endometrial cancer group was the highest， and there was a significant difference between the three groups（P<0.05）. ③There was no statistically significant difference in MSI（Microsatellite instability） phenotype at different ages and tumor differentiation levels in the endometrial cancer group（P>0.05）. ④The expression of Kras in three groups showed an increasing trend， and the difference between the groups was statistically significant（P<0.05）. ⑤The cases with MSI were all combined with Kras expression. The number of cases with MSI and Kras expression was not significantly statistically different between intimal hyperplasia with atypical lesions group and endometrial cancer group（P>0.05）. Conclusion ①MSI and Kras may be an important molecular events in the progression of endometrial carcinoma， and there is no significant relationship between the age and the degree of tissue differentiation of the patients. ②Combined detection of MMR and Kras protein may contribute to the diagnosis of endometrial lesions.

[Key words] Mismatch Repair（MMR）； MSI； Kras； Endometrium

子宮內(nèi)膜不典型增生是一種癌前病變[1]。2014 WHO女性生殖器官腫瘤分類將內(nèi)膜增生性病變簡化成增生不伴非典型及伴非典型兩大類。判斷內(nèi)膜是否存在非典型成為診斷的重點和難點[2]。

錯配修復(fù)基因（Mismatch repair genes）是一組極其保守的看家基因，負責(zé)檢查并糾正堿基錯配，包括MLH1、MSH2、PMS2和MSH6等。MMR突變會引起微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（Microsatellite instability，MSI），使基因組不穩(wěn)定、癌基因及抑癌基因發(fā)生變化，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[3]。

Kras基因存在于女性生殖系統(tǒng)及呼吸系統(tǒng)等惡性上皮腫瘤中，這些腫瘤均檢測出持續(xù)的Kras基因突變。Kras一旦突變，將處于持續(xù)激活狀態(tài)，引發(fā)腫瘤細胞無序增殖。

本研究用免疫組化法檢測子宮內(nèi)膜病變MMR及Kras蛋白的表達，探討它們的MSI和Kras蛋白表達的意義及兩者間的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月～2017年12月贛州市腫瘤醫(yī)院子宮內(nèi)膜病例108例，分為內(nèi)膜增生不伴非典型30例、增生伴非典型30例、子宮內(nèi)膜樣癌（Ⅰ型）48例。內(nèi)膜癌組32～70歲，32～40歲4例，41～50歲20例，51～60歲19例，61～70歲5例，平均（50.00±7.78）歲。所有標(biāo)本由兩名主治以上病理醫(yī)師復(fù)核，根據(jù)2014版 WHO女性生殖器官腫瘤分類標(biāo)準[4]，將內(nèi)膜癌分為子宮內(nèi)膜樣癌（Ⅰ型）以及非子宮內(nèi)膜樣癌（Ⅱ型），挑選出子宮內(nèi)膜樣癌（Ⅰ型）病例共48例，根據(jù)其分化程度分為高分化（n=15）、中分化（n=22）、低分化（n=11）。對照比較三組一般資料，差異不明顯（P>0.05），具有可比性。

1.2 儀器和試劑

儀器為羅氏診斷產(chǎn)品有限公司的全自動免疫組化儀BenchMark-XT。MLH1、MSH2、PMS2和MSH6即用型抗體均購自福州邁新試劑有限公司；Kras濃縮抗體購自武漢三鷹試劑有限公司（Kras以1∶300濃度稀釋后使用）；optiview DAB購于羅氏診斷產(chǎn)品有限公司。

1.3實驗方法

采用羅氏診斷BenchMark-XT全自動免疫組化儀進行染色。將所選組織均制成3 μm的石蠟薄片并裱于防脫玻片上，充分烤片后置入全自動免疫組化儀。把optiview DAB放在試劑架后運行儀器，中途手動滴加一抗。待運行完畢后清洗切片，脫水封片以及鏡檢。

1.4 觀察指標(biāo)與評定標(biāo)準

MLH1、MSH2、PMS2和MSH6蛋白表達均定位在細胞核和細胞質(zhì)中，以切片中非腫瘤內(nèi)膜間質(zhì)及淋巴細胞對照，細胞核和細胞質(zhì)呈棕褐色為陽性表達，無著色則為陰性。

MSI評定：微衛(wèi)星穩(wěn)定（Microsatellite stability，MSS）為4個MMR陽性；低頻度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（Low level of microsatellite instability，MSI-L）為僅有1個MMR失表達；高頻度微衛(wèi)星不穩(wěn)定（High level of microsatellite instability，MSI-H）為≥2個MMR失表達[5]。

Kras蛋白以肺癌組織對照，10%以上的細胞胞質(zhì)見淡黃或棕色表達為陽性[6]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行處理。計數(shù)資料采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MMR蛋白表達情況

MMR失表達率在內(nèi)膜增生不伴非典型、增生伴非典型和內(nèi)膜樣腺癌組呈遞增趨勢。內(nèi)膜癌以MLH1和PMS2失表達為主。MLH1、MSH2和PMS2失表達率在三組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；MSH6在三組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.189）。見表1、封三圖5、6。

2.2 MSI表型情況

內(nèi)膜癌的MSI-H及MSI-L表型比率均高于另外兩組，在三組中呈遞增趨勢，且兩兩間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表2。

2.3 子宮內(nèi)膜樣腺癌MSI與臨床特征的關(guān)系

MSI表型在≤50歲與>50歲組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.649）；在不同分化程度組間差異也無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.271）。見表3。

2.4 Kras蛋白表達情況

Kras在三組病例中表達呈遞增趨勢，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4、封三圖7。

2.5 MSI與Kras表達的相關(guān)性

具有MSI（包括MSI-H和MSI-L）的病例均伴有Kras表達。Kras陽性病例中，MSI表型比率在增生伴非典型及內(nèi)膜癌組中相似，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.703）。追蹤本研究中內(nèi)膜增生伴非典型病例，發(fā)現(xiàn)3例伴有局灶癌變，且這3例病例同時存在MSI及Kras表達。見表5。

所有子宮內(nèi)膜病例的MSI情況和Kras表達經(jīng)Spearman秩相關(guān)分析，r值為0.597，為中度相關(guān)，P值=0.00，相關(guān)性顯著。見表6。

3討論

3.1 MMR蛋白失表達的意義

MMR反應(yīng)的主體是其編碼翻譯的MMR蛋白，hMSH2與 hMSH6聚合成二聚體hMutS-α，hMLH1與hPMS2聚合成二聚體hMutL-α，hMutS-α識別發(fā)生堿基錯配的區(qū)域，hMutL-α辨別存在錯配的新生成的DNA鏈。二者共同聯(lián)接到錯配的區(qū)域，啟動修復(fù)反應(yīng)，將錯配的DNA片段切除，并合成新的DNA。MMR系統(tǒng)的相互協(xié)調(diào)作用在反應(yīng)過程中極其關(guān)鍵，任何一種產(chǎn)物功能異常將引起MMR功能異常[7]。

子宮內(nèi)膜細胞DNA復(fù)制頻率高，堿基錯配可能性大，相應(yīng)MMR基因突變概率也較高。研究表明內(nèi)膜增生伴非典型患者進展為癌的概率為20%～52%[8]，其中28%增生伴非典型及內(nèi)膜癌病例都存在MSI，推測它們可能有類似的分子生物學(xué)途徑，且在高分化內(nèi)膜樣腺癌常見[9]。趙巖等[10]研究22例內(nèi)膜非典型增生有2例存在MSI，這2例經(jīng)證實有局灶癌變。

本研究中MSI存在于子宮內(nèi)膜病變中，內(nèi)膜癌組MSI比率顯著高于另外兩組，提示MMR失表達引發(fā)的MSI可能是內(nèi)膜增生性病變發(fā)展為內(nèi)膜癌的重要分子事件。且MSI與患者年齡、腫瘤分化程度無明顯關(guān)系，與大多數(shù)研究結(jié)果一致。

3.2 Kras蛋白表達的意義

Kras基因為原癌基因，位于EGFR信號通路下游，其表達產(chǎn)物p21ras蛋白構(gòu)型因Kras激活而改變，與GTP緊密結(jié)合后始終處于活化狀態(tài)，持續(xù)激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，影響Ras/Raf/MEK/ERK/MAPK 細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控功能[11]。該信號通路一旦失控，將引發(fā)瘤細胞快速增殖、異常分化及血管形成，同時抑制腫瘤凋亡[12]。

Ⅰ型內(nèi)膜癌Kras突變率遠高于Ⅱ型，且Kras在內(nèi)膜良性病變中無表達，在增生伴非典型和內(nèi)膜癌中均有表達[13]。眾多研究顯示Kras廣泛表達于子宮內(nèi)膜癌和癌前病變，在增生伴非典型與高分化內(nèi)膜癌組間無明顯差異[14-16]，同時提出Kras檢測在內(nèi)膜癌的初診和預(yù)后評估工作中意義重大[17]。

本研究中Kras表達率在增生不伴非典型、伴非典型和內(nèi)膜癌組呈遞增趨勢，與多數(shù)學(xué)者的報道相符。內(nèi)膜癌組表達率顯著高于另外兩組，提示Kras可能是引發(fā)內(nèi)膜癌的重要分子事件，在其發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用。Kras高表達于大部分內(nèi)膜癌中，表達強度相似，推測其表達程度與分化程無明顯關(guān)系，與部分學(xué)者[14]報道的Kras表達程度及強弱與內(nèi)膜癌的分化程度相關(guān)不符，可能與參與實驗的病例差異及選取的 Kras抗體不同有關(guān)。Kras在三組病例中均有表達，無法單純通過檢測Kras來鑒別診斷。本研究采用免疫組化法檢測Kras，體現(xiàn)的是Kras蛋白表達情況，結(jié)構(gòu)類似的蛋白都可能表達，使本實驗Kras表達率較高，并不能完全代表所檢組織Kras基因的真實情況。建議后續(xù)實驗可用PCR法檢測內(nèi)膜病變組織Kras基因突變情況，并將結(jié)果與本實驗結(jié)果對比、分析。

3.3 聯(lián)合MMR與Kras蛋白檢測的意義

子宮內(nèi)膜癌發(fā)生需經(jīng)過MSI、PTEN、Kras和β-catencin基因突變4種分子學(xué)變化，MSI引起癌基因和抑癌基因突變、效果增聚，后三者突變則影響細胞信號傳導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[18]。文獻報道，散發(fā)性內(nèi)膜癌MSI和Kras突變率分別為25%～30%及10%～30%，Kras突變常發(fā)生于存在MSI的腫瘤。本研究中存在MSI的病例均伴Kras表達，且增生伴非典型和內(nèi)膜癌組中同時存在MSI及Kras表達的病例比率相似，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這也許表明MSI和Kras在增生伴非典型和內(nèi)膜癌中同等重要，二者同時表達提示病變惡化。MSI與Kras蛋白表達的相關(guān)性分析提示，兩者具有一定的相關(guān)性，在MSI的病例中，Kras蛋白陽性可能性大，在MSS的病例中，Kras蛋白陰性的可能性大。此外30例增生伴非典型的病例中發(fā)現(xiàn)3例局灶癌變，經(jīng)證實這3例病例均有MSI和Kras表達。這也許提示內(nèi)膜增生中，若同時發(fā)現(xiàn)MSI和Kras表達，其伴有非典型且癌變的概率可能大于無MSI和Kras表達的病例。本研究中此類病例數(shù)較少，無法充分證實此推論，建議后續(xù)實驗加大不典型增生合并癌變的病例數(shù)，進一步探討上述推論是否成立。

綜上所述，內(nèi)膜增生性病變難以鑒別其非典型或癌變時，MMR及Kras蛋白的共同檢測，可能有助于協(xié)助診斷，并及早給予患者相應(yīng)治療，最終達到提高內(nèi)膜癌患者生活質(zhì)量及生存率的目的。

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（收稿日期：2018-04-03）