麗格海棠葉片快速繁殖技術的優(yōu)化

胡燕梅，向鵬飛，李凱鵬

（1.江漢大學 期刊社，湖北 武漢 430056；2.武漢生物工程學院 生命科學與技術學院，湖北 武漢 430415）

麗格海棠（begonia×elatior）為秋海棠科秋海棠屬多年生草本花卉，是球根秋海棠和野生秋海棠的雜交品系。麗格海棠株形豐滿，花形和玫瑰相似，故又名玫瑰海棠。其花色豐富，花朵碩大，色彩艷麗。我國20世紀90年代從國外引進該品種，近年來在國內發(fā)展很快，目前是國際花卉市場上非常暢銷的盆花之一［1］。麗格海棠一般不形成種子，多采用扦插繁殖。其扦插繁殖主要采用葉插和莖插為主，但是扦插過程中很容易爛根，且繁殖速度較慢，不能滿足市場需要［2-3］。植物組織培養(yǎng)技術能夠快速繁殖優(yōu)質種苗，在一定程度上可以滿足市場需求，目前已廣泛應用于觀賞植物的種苗生產［4-7］。本試驗以麗格海棠的幼嫩葉片為材料，進行體外再生培養(yǎng)，優(yōu)化麗格海棠快速繁殖體系，以期為其工廠化育苗打下基礎。

1 材料與方法

1.1 無菌材料的獲得

麗格海棠采購于武漢林業(yè)有限責任公司。選取生長健壯的麗格海棠作為母株材料，摘取植株上已平展的幼葉，用含少量洗衣粉的清水洗約2 min，洗凈后流水沖洗30 min，置超凈工作臺上酒精處理30 s，然后放入0.1%的升汞溶液中浸泡消毒8 min，再用無菌水沖洗5～6次后取出。用無菌濾紙將材料吸干，用解剖刀先切去葉片的邊緣后將葉片切成1 cm2的小片，每片最好帶有葉脈，然后通過無菌操作進行接種，接種材料的培養(yǎng)條件為：溫度23～27℃，光照度1 000～2 000 lx，光照周期12～14 h/d。

1.2 不定芽的誘導

1.2.1 基本培養(yǎng)基對葉片不定芽分化的影響 將消毒好的外植體葉片接種于基本培養(yǎng)基MS、N6和B5中，每種基本培養(yǎng)基中加 1.0 mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30 g/L 蔗糖 +8g/L 瓊脂，pH5.8。每個處理接種18個外植體。培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計有效接種數、分化不定芽的有效接種數、分化的不定芽數、有效不定芽數（葉柄長度和葉片直徑超過1 cm的不定芽），并計算不定芽分化率和不定芽分化系數。

有效接種數：接種后沒有污染的外植體葉片數；

分化率＝（分化不定芽的外植體葉片數/有效接種數）×100%；

不定芽分化系數＝分化的不定芽數/有效接種數；

有效不定芽分化系數＝有效不定芽數/有效接種數。

1.2.2 6-BA與兩種生長素對葉片不定芽分化的影響 以MS+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基，6-BA設5個梯度，分別為：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，NAA和IBA濃度為0.1 mg/L。將消毒好的外植體葉片接種到這10組培養(yǎng)基中，每個處理接種18個外植體。

后續(xù)試驗又以細胞分裂素6-BA濃度1.0 mg/L為基礎，生長素IBA和NAA設3個梯度，分別為：0.1、0.2、0.3 mg/L，檢測兩種生長素不同的3個濃度對不定芽分化的影響。

培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計有效接種數、分化不定芽的有效接種葉片數、分化的不定芽數、有效不定芽數，并計算不定芽分化率和不定芽分化系數。

1.2.3 培養(yǎng)基介質對不定芽芽團增殖的影響 1.2.2培養(yǎng)過程中有大量不定芽芽團形成，在實際生產中這些芽團由于不定芽過于密集而不能單獨作為種苗加以利用而被廢棄，增加了生產成本。本試驗中將直徑約1 cm的不定芽芽團接入不同培養(yǎng)基的培養(yǎng)介質中，以探討不定芽芽團繼續(xù)生長的效果。

以MS+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖為培養(yǎng)基，設計不同培養(yǎng)介質為：濾紙（2層）、紗布（4層）、棉花（厚度0.5 cm）、液體培養(yǎng)基，以8 g/L瓊脂作為對照并記為CK。選取1.2.2中直徑約1 cm的芽團作為外植體進行接種，以檢測5種介質對芽團后期長勢的影響，每個處理接種10個外植體，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計芽團直徑、有效芽增殖數，計算芽團增殖倍數和有效芽增殖系數。

芽團增殖倍數=45 d后芽團直徑/接種前芽團直徑；

有效芽增殖系數=有效芽增殖數/接種的芽團數。

1.2.4 蔗糖對不定芽芽團增殖的影響 選取1.2.2中直徑約1 cm的芽團作為外植體，分別接種到蔗糖濃度為10、15、20、30、40 g/L的培養(yǎng)基中，以檢測不同濃度蔗糖對不定芽芽團生長的影響。每個處理接種10個外植體，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計芽團直徑、有效芽增殖數，計算芽團增殖倍數和有效芽增殖系數。

1.3 不定根的誘導

1.3.1 IBA和NAA分別對不定根誘導的影響 以1/2 MS+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基，選取1.2中長勢健壯的不定芽為接種材料，分別接種于IBA和NAA不同濃度的生根培養(yǎng)基中。每個處理接種18個不定芽，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計分化不定根的材料數、不定根的誘導總數，計算生根率和生根系數。

生根率＝（分化不定根的材料數/有效接種數）×100%；

生根系數＝不定根的誘導總數/有效接種數。

1.3.2 活性炭對不定根誘導的影響 以1/2 MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂為生根培養(yǎng)基。選取1.2中所獲得的長勢健壯的不定芽為外植體，分別接種于活性炭（AC）不同濃度的生根培養(yǎng)基中。每個處理接種18個外植體，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計結果并計算生根率和生根系數。

1.3.3 PP333對不定根誘導的影響 以 1/2 MS+0.1mg/L NAA+30g/L 蔗糖+8 g/L 瓊脂為基本生根培養(yǎng)基。選取1.2中所獲得的長勢健壯的不定芽為外植體，分別接種于多效矬（PP333）不同濃度的生根培養(yǎng)基中。每個處理接種18個外植體，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計結果并計算生根率和生根系數。

1.4 試管苗煉苗移栽

選取長勢健壯并且均勻一致的單芽試管苗，松動封口膜3 d后打開封口膜，5 d后用無菌水洗凈根部培養(yǎng)基，分別移栽于煉苗基質中。3種煉苗基質成分為：Ⅰ號基質為泥炭土∶珍珠巖=5∶2；Ⅱ號基質為泥炭土∶珍珠巖∶鋸末 =3∶1∶1；Ⅲ號基質為泥炭土∶鋸末=1∶1。

3種煉苗基質均經過高溫滅菌，每種處理移栽10株試管苗，隔天上午噴水。煉苗條件為：溫度23～27 ℃，光照度1 000～2 000 lx，光照周期12～14 h/d。

定期觀察，統(tǒng)計結果，計算成活率。

2 結果與分析

2.1 不定芽的誘導

2.1.1 基本培養(yǎng)基對葉片不定芽分化的影響 幼嫩葉片在3種培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d后少量葉片的切口處變厚，有翠綠色芽點出現。繼續(xù)培養(yǎng)葉片邊緣的芽點形成明顯小芽，后期更多葉片上直接分化出大量不定芽（圖1）。培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計分化率及分化系數，結果見表1。

圖1 外植體葉片上分化不定芽Fig.1 Adventitious bud differentiation on explant leaves

表1 基本培養(yǎng)基對葉片不定芽分化的影響Tab.1 Effects of basic mediums on adventitious bud differentiation of leaves

從表1可以看出MS基本培養(yǎng)基誘導葉片分化不定芽的效果明顯優(yōu)于B5和N6，其分化率達到100%，分化系數達到了10.8，且有效芽分化系數較高，達到了4.6。分化出的新芽葉片長勢良好，葉片嫩綠肥大，葉柄長且粗。N6培養(yǎng)基的分化率為72.9%，分化系數達到8.7，且有效芽數較少，有效芽分化系數僅1.5，其不定芽長勢也不理想，葉柄細長、葉片較小。B5培養(yǎng)基在前15 d長勢超過了MS和N6，但是其不定芽的葉柄粗短，不定芽數量多而密集成簇，且在培養(yǎng)后期葉片開始枯黃。綜上所述，本試驗選擇MS為適宜基本培養(yǎng)基。

2.1.2 6-BA與兩種生長素對麗格海棠葉片不定芽分化的影響 將麗格海棠的幼嫩葉片切塊接種到不同濃度6-BA和兩種生長素NAA及IBA的培養(yǎng)基上生長培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計試驗結果見表2和表3。

表2 不同濃度6-BA與兩種生長素組合對不定芽分化的影響Tab.2 Effects of combination of 6-BA with different concentrations and two auxins on adventitious bud differentiation

表3 6-BA與兩種不同濃度生長素組合對不定芽分化的影響Tab.3 Effects of combination of 6-BA and two auxins with different concentrations on adventitious bud differentiation

從表2可以看出6-BA濃度相同時NAA處理在分化率和分化系數兩個指標上均較IBA處理效果更好，表明生長素NAA更適合于麗格海棠葉片分化出不定芽。但在NAA處理上，隨著6-BA的濃度由0.5 mg/L增加到2.5 mg/L時，分化率和分化系數均出現了先上升后下降的趨勢，其中1.0mg/L的6-BA處理效果最好，分化率為100%，分化系數為10.7，有效芽分化系數達到4.4。6-BA濃度較低時分化出的新芽長勢較正常，新芽葉片寬大，葉柄長，后期隨著6-BA濃度升至2.0 mg/L時有效芽分化系數為0，分化出的新芽長勢較差，葉柄短、葉片小，新芽簇生成團狀（圖2），很多無法進行后期繼代培養(yǎng)和生根培養(yǎng)。所以選擇1.0 mg/L 6-BA為最適細胞分裂素濃度。

圖2 簇狀的不定芽芽團Fig.2 Cluster of adventitious buds

從表3可以看出培養(yǎng)基中只添加細胞分裂素6-BA而不加生長素時葉片均枯死，表明生長素對于麗格海棠葉片誘導不定芽起著重要作用，即沒有生長素會導致葉片直接枯死。NAA和IBA為0.1 mg/L時，不定芽的葉柄粗短，平均長度在0.5 cm左右，葉片較小，平均大小只有0.7 cm2。隨著IBA的濃度由0.1 mg/L增加到0.2 mg/L時，IBA的分化率由82.6%達到了84.3%，分化系數由4.7達到了8.2。但NAA處理組的分化率均達到了100%，分化系數最高達到11.8，明顯優(yōu)于IBA。但當NAA和IBA為0.3 mg/L時，雖有大量不定芽分化，但是不定芽生長成球狀，幾乎無葉柄的生成，葉片呈尖三角形狀，而與正常圓形葉片差異較大（圖2），說明高濃度的生長素雖能促進不定芽分化，但能獲得的有效芽卻很少。綜上所述：生長素的種類以NAA為好，濃度以0.2 mg/L適宜。

2.1.3 培養(yǎng)基介質對不定芽芽團生長的影響 將不定芽芽團接種到不同介質的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，其對不定芽芽團吸收營養(yǎng)的快慢和生長程度影響各不相同。培養(yǎng)第15天時無介質的培養(yǎng)基即液體培養(yǎng)基上芽團最先生長，體積膨大，并伴隨部分葉片開始張開成圓形，有葉柄生成。后期培養(yǎng)棉花、紗布為介質的培養(yǎng)基上也出現以上現象，瓊脂和濾紙的生長效果相對較差。45 d后的生長情況統(tǒng)計見表4。

表4 培養(yǎng)介質對不定芽芽團生長的影響Tab.4 Effects of mediums on growth of adventitious buds

由表4可知，接種的不定芽芽團培養(yǎng)45 d后體積均有較大增加。其中液體培養(yǎng)基芽團增殖倍數最大，達到5.6倍，有效芽增殖系數達到8.6。表明液體培養(yǎng)基不加任何介質更適于不定芽芽團生長獲得有效芽，能為后期生產提供更多芽苗，且成本更低廉，建議生產中若出現了不定芽芽團，可以以液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)以獲得更多有效芽。

2.1.4 蔗糖對不定芽芽團生長的影響 將不定芽芽團接種到不同蔗糖濃度的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10 d后，20 g/L蔗糖處理組最先出現明顯的體積膨大，葉柄增長，葉片變寬大。30 d后其他處理也開始有明顯的體積膨大。45 d后統(tǒng)計結果（見表5）。

表5 蔗糖對不定芽芽團生長影響Tab.5 Effects of sucrose on growth of adventitious buds

從表5可知，不定芽芽團在蔗糖濃度為40 g/L時芽團的增殖效果最好，增殖倍數達到6.2，但有效芽增殖系數卻僅有3.6，可能是蔗糖濃度過高，營養(yǎng)過于豐富，利于整個芽團生長而不利于單個有效芽抽出。而低濃度的蔗糖培養(yǎng)基上芽團雖有生長，但均不及30 g/L蔗糖處理組的不定芽芽團的增殖倍數及有效芽增殖系數。

2.2 生根的誘導

2.2.1 IBA和NAA分別對不定根誘導的影響 將約2 cm高的健壯芽接到生根誘導培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，20 d后部分芽有少量根萌發(fā)，后期大量不定根生長的同時大量芽也長勢旺盛，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計生根情況（見表6）。

表6 生長素對不定根誘導的影響Tab.6 Effects of auxins on inducing of adventitious roots

從表6結果可以看出培養(yǎng)基中不加生長素，生根率為0，且芽的長勢較差。但加入生長素后，生根率普遍提高，表明麗格海棠自我生根能力較差。在NAA與IBA組合中，當NAA濃度相同時，隨著IBA濃度增加，不定根的生長情況越差；整體來說以NAA濃度為0.1 mg/L時效果最佳，尤其在單獨添加0.1 mg/L NAA的處理中，其生根率高達100%，生根系數也達到8.6，而且芽的長勢也非常旺盛?？梢妰煞N生長素使用中，NAA效果明顯好于IBA。

2.2.2 活性炭對麗格海棠生根的影響 將不定芽接種到不同濃度活性炭的誘導培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，定期觀察。對照組即不添加活性炭的處理組不定芽有大量根出現，且芽長勢旺盛。培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計生根情況（見表7）。

表7 活性炭對不定根誘導的影響Tab.7 Effects of activated carbon on inducing of adventitious roots

從表7中可以看出沒有加入活性炭的對照組的生根率和生根系數均最好，表明活性炭對不定根的誘導無促進作用。由于光可誘發(fā)培養(yǎng)基中植物激素的降解，而活性炭的添加削弱了試管苗基部的光照強度［8］，所以活性炭提供的暗環(huán)境可保證植物生長所需的調節(jié)物質的結構穩(wěn)定性與活性。但同時活性炭可能對激素有吸附作用，所以高濃度的活性炭會影響試管苗對植物激素的利用［9］。本試驗結果顯示活性炭添加對不定根生長不僅無促進作用，反而有抑制作用，說明其對促進不定根形成的生長素NAA有較強的吸附作用。

2.2.3 PP333對不定根誘導的影響 將不定芽接到含有不同濃度PP333的不定根誘導培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計生根情況（見表8）。

表8 PP333對不定根誘導的影響Tab.8 Effects of PP333on inducing of adventitious roots

從表8中可以看出0.1 mg/L PP333處理組不定芽的生根率和生根系數均和對照沒有明顯差異，但從長勢來看該處理組的試管苗根變粗，小苗粗壯，說明PP333有利于麗格海棠試管苗的整體長勢，可以為后期的煉苗移栽提供較好的基礎材料來源。這與呂文濤等［10］的研究結果一致。

2.3 試管苗煉苗移栽

麗格海棠試管苗分別移栽入3種煉苗基質中生長，定期觀察，統(tǒng)計成活率（見表9）。

表9 試管苗的成活率Tab.9 Survival rate of test tube seedlings

從表9可以看出Ⅰ號基質處理的成活率最高，所以泥炭土與珍珠巖比例為5∶2時適宜作為試管苗移栽的基質。且從表中可以看出，第5天到第10天小苗的成活率普遍下降很快，而過了這個時期又趨于平緩。說明移栽苗的存活能力在5～10 d有一個臨界期，跨越這個臨界期后試管苗存活的概率增加，這與賈清華等［11］的研究結果一致。

3 討論

由于麗格海棠在自然界的扦插繁殖主要采用成熟葉片進行，也就是說葉片是其自然繁殖的主要器官，所以在進行麗格海棠的離體培養(yǎng)時首選外植體部位為其幼嫩葉片。

植物快繁過程中培養(yǎng)物的增殖方式有多種，其中常見的有叢生芽增殖方式［12］、不定芽增殖方式［13］、原球莖增殖方式［14］和愈傷組織增殖方式［15］，而麗格海棠的葉片主要是不定芽增殖方式，即從葉片上直接分化出大量的不定芽，繞過了愈傷組織階段，這樣對快速繁殖體系的建立可以節(jié)約大量時間。

本試驗結果表明不同的基本培養(yǎng)基在不同的時間段會有不同的試驗效果，在前15 d，B5培養(yǎng)基較MS和N6能夠使葉片更快分化不定芽，但是到15 d后B5培養(yǎng)基中的試驗苗普遍出現了枯萎的現象，其中原因還有待研究。MS培養(yǎng)基中的不定芽生長健康，葉柄、葉片比N6培養(yǎng)基中的不定芽更加粗壯和茂盛，則在本試驗中選擇MS為適宜基本培養(yǎng)基。

李玲［16］采用0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA 激素組合，在此條件下，不定芽的莖生長較快，但較細長，存在失綠的現象。采用1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA時，其莖生長粗壯，30 d后開始展出綠色小葉，45 d形成小植株體?？梢娫鲋仇B(yǎng)基中激素配比以1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA比較適宜。這與本試驗結果一致，培養(yǎng)基中要有適當的生長素存在和細胞分裂素起協同效應才能更好地刺激不定芽的分化。王海朋等［17］發(fā)現培養(yǎng)基中無生長素時大量的麗格海棠‘宣言’品種的外植體葉片枯黃和死亡，與本試驗中NAA和IBA為0 mg/L時所有葉片均枯死的試驗現象是一致的，證明生長素對葉片的生長有重要作用。隨著生長素濃度的增加分化系數也增加，當生長素的濃度達到0.3 mg/L時，分化的不定芽成球狀，幾乎無莖和葉柄出現，或者葉柄很短?？梢娗捌谏L素的濃度篩選設計在0.1～0.3 mg/L是可行的。李曉東等［18］發(fā)現麗格海棠葉片進行不定芽增殖的同時伴有根系生成，說明麗格海棠含有一定量的內源生長素，而在本試驗過程中沒有發(fā)現此現象，可能是由于試驗材料所選麗格海棠品種不同所致。芽團生長試驗表明直接將芽團接入液體培養(yǎng)基中利于芽團有效芽的生長，為生產中大量不定芽的后續(xù)利用提供了可能，否則不定芽芽團將有可能直接廢棄，增加了生產成本。

麗格海棠組培苗對生根培養(yǎng)基中的激素質量濃度要求也較為嚴格，最適宜的生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg/L NAA，其生根率高達100%。即在培養(yǎng)基中單獨加入NAA而不加6-BA也能很好地誘導不定根的形成。但并非NAA的使用濃度越高效果就越好，即需要適宜濃度。潘梅等［19］的研究表明根數和生根率同激素質量濃度呈現不均勻的變化，根的粗壯程度與激素質量濃度的增加并無規(guī)律性的變化，當激素質量濃度超過一定范圍，生根數目相對較少，根的分化效果也不理想，而且有大量愈傷組織形成。這一結果與本試驗結果有相似之處，說明NAA適宜濃度的選擇對生根效果的影響是很大的。培養(yǎng)基中添加活性炭不利于生根，但多效矬處理卻生根效果明顯，且芽苗更粗壯，利于后期煉苗移栽。