3D打印的多聚甲醛硅氧烷仿生納米銀復合材料及性能研究

施高強，羅高興，陳希煒，譚江琳，劉夢龍，劉騰飛，謝小蓉，吳軍

目前臨床上可供選擇的傷口敷料，包括天然材料和合成材料兩大類，其中合成材料常用的有殼聚糖[1]、藻酸鹽[2]、硅膠[3]、聚丙烯酰胺[4]、聚乳酸[5]等。這些材料不僅具有柔韌性好、安全、生物相容性好、無毒等特性，而且還能吸收大量的創(chuàng)面分泌物，使創(chuàng)面保持理想的濕度，從而提供一個令人滿意的創(chuàng)面愈合環(huán)境，但在抵抗細菌感染、抑制細菌黏附和殺滅細菌方面仍存在明顯不足[6-7]。解決此問題的思路是將抗菌劑整合到創(chuàng)面敷料中，使之獲得抗感染能力。典型的局部抑菌劑有碘酒[8]、三氯苯氧氯酚[9]、季銨鹽[10]、納米銀[11]、氯胺[12]等。多聚甲醛硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)是一種具有疏水性、無毒、生物相容性好及橡皮樣彈性的聚合物，在醫(yī)用敷料的制備中具有良好的應用前景[13-14]。近年來，有學者提出通過對PDMS灌注大量潤滑液，從而獲得一個光滑面，使之具有抗黏附作用[15-16]。本研究旨在以硅油灌注的聚二甲基硅氧烷(oil-infused polydimethylsiloxane，iPDMS)為基礎，整合納米銀使之獲得良好的抗感染能力，制備出一種兼具抗黏附和抗感染的硅油灌注的多聚甲醛硅氧烷仿生納米銀復合材料(oil-infused polydimethylsiloxane with anti-bacterial nanosilver，iPDMS/AgNPs)[17-18]。

1 材料與方法

1.1 PDMS 和多聚甲醛硅氧烷仿生納米銀復合材料(oil-infused polydimethylsiloxane with anti-bacterial nanosilver，PDMS/AgNPs)的墨水準備 將預聚物和固化劑按照質(zhì)量比1:1混合制成可打印的墨水；徹底攪拌，添加質(zhì)量比為0.5%和2.5%的納米銀；將混合物在冰浴下超聲處理1h；置于60℃熱水浴中30min，形成最后的墨水。

1.2 3D打印 所有創(chuàng)面敷料均采用3D打印機(HKable 3D)構(gòu)建。將墨水注入推出注射器(通過一個20G平頭電極針固定在傳送機上)。打印期間，不同需求的3D形狀依據(jù)計算機輔助設計裝在一個載玻片上。打印后，樣品放在熱水浴中保持2h，直到完全固化。

1.3 iPDMS和iPDMS/AgNPs的準備 完全固化后，3D打印的PDMS和PDMS/AgNPs膜片首先用乙醇漂洗并干燥，轉(zhuǎn)移至一個充滿5cst硅油的玻璃容器中，浸泡18h。準備足夠量的6組膜片用于后續(xù)實驗，分別為PDMS、iPDMS、PDMS+0.5%AgNPs、PDMS+2.5%AgNPs、iPDMS+0.5%AgNPs和iPDMS+2.5%AgNPs。

1.4 掃描電子顯微鏡和能譜檢查 通過掃描電子顯微鏡和能譜(Hitachi，S-3400N，Japan)觀察iPDMS/AgNPs納米復合材料的形態(tài)特征。將樣品用去離子水小心清洗、干燥并進行金包被；在真空條件下通過掃描電子顯微鏡觀察；將iPDMS和iPDMS/AgNPs的膜片添加到200目碳膜包被的銅網(wǎng)上，樣品在空氣中自然干燥后，采用能譜儀檢測材料的成分。

1.5 實驗動物 健康雄性BALB/c小鼠購于陸軍軍醫(yī)大學動物研究所，共12只，體重25g左右，飼養(yǎng)于SPF級飼養(yǎng)間，室溫25℃，相對濕度50%，晝夜節(jié)律12h/12h。實驗開始前小鼠分單籠適應性飼養(yǎng)1周。本研究所有實驗操作均符合陸軍軍醫(yī)大學實驗動物倫理委員會的相關倫理要求。

1.6 細胞毒性實驗

1.6.1 成纖維細胞原代培養(yǎng) 取新生綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠，75%乙醇消毒，PBS漂洗3次，超凈工作臺內(nèi)剝?nèi)⌒律笃つw，盡量去除皮下組織后，剪成約0.5cm×0.5cm大小的皮片，表皮面向上、真皮面向下漂浮浸泡于預先配制好的0.5% DispaseⅡ溶液中(注意DispaseⅡ溶液盡量不要接觸到表皮面)，4℃過夜。次日取浸泡后的皮片，使用眼科鑷輕柔分離皮膚的表皮和真皮并收集真皮組織，PBS漂洗后，于無菌三角錐瓶中將真皮組織盡量剪碎，加入0.25%胰酶溶液后用封口膜封口，置于37℃恒溫搖床內(nèi)輕柔搖晃消化10min。加入預先配制好的DMEM培養(yǎng)基終止消化后，轉(zhuǎn)移至15ml離心管內(nèi)，1000r/min離心10min，棄上清，重懸細胞，接種至25cm培養(yǎng)瓶內(nèi)，每個培養(yǎng)瓶內(nèi)補充培養(yǎng)基至5ml，置37℃、5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。接種后第1天進行細胞換液，此后每隔2～3d換液1次，視細胞生長密度進行傳代。后續(xù)實驗使用第2和第3代的細胞。普通小鼠的成纖維細胞原代培養(yǎng)采用相同的方法。

1.6.2 CCK-8試驗 膜片置于96孔板內(nèi)，每孔一張膜片并置于底部。配制含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，更換原培養(yǎng)基培養(yǎng)48h以同步細胞周期。制備1×104/ml濃度的成纖維細胞懸液，接種到96孔板內(nèi)，每孔100μl。接種后的第1～6天，每天使用CCK-8試劑檢測膜片上的細胞數(shù)量。檢測步驟如下：將膜片轉(zhuǎn)移到新的96孔板中，PBS緩沖液輕柔漂洗3次，加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基100μl，再加入10μl CCK-8試劑后，37℃孵育1h，采用酶標儀于450nm處檢測溶液的吸光度(OD)值。

1.7 抗黏附試驗 使用臨床上常見的標準耐藥菌金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌，先擴增細菌(搖菌過夜)至1×109cfu/ml，然后將菌液稀釋至1×104cfu/ml。材料預處理(n=3)：75%乙醇室溫浸泡20min滅菌，PBS洗3次。細菌黏附及培養(yǎng)：向含膜片的孔內(nèi)加入200μl稀釋后的菌液，37℃孵育1.5h；PBS漂洗1次；將膜材料貼于平皿的底部，展平，倒入預熱冷卻至45℃的LB瓊脂，凝固后37℃培養(yǎng)過夜。最后取出平皿，拍照、計數(shù)。

1.8 體外抗菌活性實驗

1.8.1 細菌準備 采用臨床上常見的標準耐藥菌金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌，先擴增細菌(搖菌過夜)至1×109cfu/ml后凍存，取200μl凍存菌液加入10ml LB培養(yǎng)基中，200r/min離心30min，37℃過夜培養(yǎng)至對數(shù)生長期，稀釋菌液至OD值=0.07。

1.8.2 材料預處理(n=3) 將材料剪切成1cm×1cm大小，75%乙醇室溫浸泡20min滅菌，PBS洗3次，每次5min。

1.8.3 共培養(yǎng)及檢測 向含一片材料的24孔板孔內(nèi)加入500μl稀釋后的菌液，37℃下50r/min振蕩孵育24h，測定菌液OD值。

1.9 iPDMS/AgNPs在小鼠全層皮膚感染創(chuàng)面中的應用 構(gòu)建小鼠全層皮膚感染創(chuàng)面模型，觀察iPDMS/AgNPs對創(chuàng)面愈合率、新生上皮長度和肉芽組織厚度的影響。

1.9.1 材料準備 將材料分為8組，分別為陰性對照(A)組(無菌，只貼負壓膜)、陽性對照(B)組(既滴菌又貼負壓膜)、PDMS(C)組、iPDMS(D)組、PDMS+0.5%AgNPs(E)組、PDMS+2.5%AgNPs(F)組、iPDMS+0.5%AgNPs(G)組、iPDMS+2.5%AgNPs(H)組，均用打孔器制成6mm直徑圓片，酒精消毒、PBS漂洗后烤干。

1.9.2 細菌準備 制備菌液濃度為1×108cfu/ml的臨床上常見的標準耐藥菌金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌混合液。

1.9.3 動物準備 12只8～10周BALB/c雄性小鼠用剃發(fā)器剃毛、脫毛膏清除干凈毛發(fā)后，在背部對稱打兩個直徑為6mm的圓形皮膚全層創(chuàng)面。

1.9.4 實驗過程 分別于創(chuàng)面上滴加15～20μl的細菌懸液，稍微晾干，分別采用1.9.1中準備的8組材料覆蓋創(chuàng)面。于第1、3、5、7天揭開創(chuàng)面拍照，每組更換對應的敷料，外層貼固定膜，分析創(chuàng)面大小并進行統(tǒng)計分析。

1.10 創(chuàng)面愈合率評價 在傷后第1、3、5、7天對創(chuàng)面拍照后，采用IPP 6.0軟件進行測量，應用以下公式計算創(chuàng)面愈合率：創(chuàng)面愈合率(%)=(原始創(chuàng)面面積－殘余創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積×100%。

1.11 病理組織學觀察 在傷后第3天和第7天處死小鼠，每組各3只，提取創(chuàng)面組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色，Image J軟件測量新生上皮的長度和肉芽組織厚度。

1.12 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 iPDMS/AgNPs的制備及形態(tài)學觀察結(jié)果 通過一臺全能3D打印機獲得可調(diào)的iPDMS/AgNPs創(chuàng)面敷料(圖1A)；iPDMS/AgNPs可以輕易地折疊和拉伸(圖1B1、B2)；硅油修飾的PDMS膜片表面光滑無凸起(圖1C)，納米銀點綴的iPDMS膜片表面有較為均勻的凸起存在，平均直徑為14.8nm(圖1D)；iPDMS/AgNPs的能譜觀察顯示含有1.1%銀元素(圖1E)。

2.2 iPDMS/AgNPs對小鼠成纖維細胞的毒性作用觀察 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，不同納米銀濃度的iPDMS/AgNPs對培養(yǎng)1～7d的小鼠成纖維細胞均無明顯細胞毒性(P＞0.05，圖2)。

2.3 iPDMS/AgNPs對細菌的抗黏附作用 6組膜片與金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌共培養(yǎng)后的肉眼觀見圖3。與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)的6組膜片細菌菌落數(shù)分別為(10.3±2.5)cfu/皿、(2.0±2.0)cfu/皿、(50.7±3.5)cfu/皿、(46.3±2.1)cfu/皿、(9.7±3.1)cfu/皿、(0.3±0.6)cfu/皿，與大腸埃希菌共培養(yǎng)的6組膜片細菌菌落數(shù)分別為(9.3±2.5)cfu/皿、(1.0±1.0)cfu/皿、(43.7±3.5)cfu/皿、(37.7±3.2)cfu/皿、(10.3±1.5)cfu/皿、(0.7±1.2)cfu/皿。統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示，硅油修飾的膜片細菌菌落數(shù)明顯少于其他組(P＜0.05，圖4)，即iPDMS/AgNPs膜片可有效抵抗金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的黏附。

2.4 iPDMS/AgNPs的體外抗菌活性觀察 6組膜片與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)時，OD值分別為1.220±0.018、1.133±0.035、0.948±0.031、0.744±0.053、0.781±0.046、0.587±0.045，與大腸埃希菌共培養(yǎng)時，OD值分別為0.611±0.017、0.597±0.014、0.538±0.023、0.392±0.011、0.392±0.014、0.278±0.040。統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示，納米銀修飾的膜片組OD值明顯低于其他組(P＜0.05，圖5)，即iPDMS/AgNPs膜片可抑制金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的生長。

2.5 iPDMS/AgNPs對小鼠全層皮膚感染創(chuàng)面愈合的影響 傷后第1、3、5、7天各組膜片創(chuàng)面愈合的肉眼觀見圖6。在傷后第3天，8組膜片的創(chuàng)面愈合率分別為18.97%±0.73%、6.30%±0.49%、10.50%±0.40%、14.30%±1.02%、24.43%±0.73%、28.93%±1.07%、28.00%±1.11%、32.73%±1.45%，而傷后第7天分別為58.53%±2.43%、19.93%±0.96%、27.63%±1.10%、40.12%±1.03%、61.57%±1.01%、73.17%±2.07%、73.03%±1.15%、82.60%±1.42%，統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示，在傷后第3天和第7天，E、F、G和H組創(chuàng)面愈合率高于B組(P＜0.05)，在傷后第

7天，H組的創(chuàng)面愈合率高于A組(P＜0.05，圖7)，即iPDMS/AgNPs能有效提高創(chuàng)面的愈合率。

圖1 iPDMS/AgNPs的特征Fig.1 Micrographs of 3D-printed mesh and nonosilver dotting

圖2 iPDMS/AgNPs對小鼠成纖維細胞增殖的影響Fig.2 Effects of iPDMS/AgNPs on fibroblast proliferation in mice

圖3 6組膜片與金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌共培養(yǎng)后的肉眼觀Fig.3 Gross appearance of six groups of iPDMS/AgNPs films co-cultured with Staphylococcus aureus or Escherichia coli

圖4 6組膜片與金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌共培養(yǎng)的細菌菌落數(shù)比較Fig.4 Colony count of six groups of iPDMS/AgNPs films co-cultured with Staphylococcus aureus or Escherichia coli

圖5 6組膜片分別與金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌共培養(yǎng)的OD值比較Fig.5 Comparison of OD value of 6 groups of iPDMS/AgNPs films co-cultured with Staphylococcus aureus or Escherichia coli

2.6 iPDMS/AgNPs對小鼠全層皮膚感染創(chuàng)面新生上皮長度的影響 本研究應用傷后第3天和第7天肉芽組織上新生上皮的長度作用新生上皮再生的指標，其肉眼觀見圖8。傷后第3天各組新生上皮長度無明顯差異；傷后第7天8組膜片新生上皮長度分別為(727.10±27.99)μm、(422.47±28.90)μm、(444.13±33.03)μm、(573.33±41.97)μm、(754.53±30.36)μm、(816.30±37.68)μm、(958.80±54.02)μm、(1173.53±88.74)μm。統(tǒng)計學分析結(jié)果顯示，在傷后第7天，E、F、G和H組的新生上皮長度長于B和C組(P＜0.05，圖9)，即制備的復合材料膜片iPDMS/AgNPs可明顯增加再生上皮長度。

2.7 iPDMS/AgNPs對小鼠全層皮膚感染創(chuàng)面肉芽組織厚度的影響 傷后第7天8組膜片肉芽組織厚度分別為(515.93±52.14)μm、(241.13±40.72)μm、(317.83±24.77)μm、(503.97±45.50)μm、(639.80±48.76)μm、(748.87±40.54)μm、(833.20±33.93)μm、(964.23±64.33)μm，統(tǒng)計學分析顯示，E、F、G和H組的平均肉芽組織厚度明顯大于B組(P＜0.05)，且G和H組的平均肉芽組織厚度明顯大于A組(P＜0.05，圖10、11)。

3 討 論

皮膚燒傷在平戰(zhàn)時較為常見，其伴隨細菌感染可同時損害人皮膚的表皮和真皮層，導致創(chuàng)面加深甚至死亡[19]。因此，對于燒傷患者而言，避免創(chuàng)面感染對于促進其愈合至關重要[20]。臨床上使用的燒傷創(chuàng)面敷料不僅應具有抗感染能力，還需具有抗黏附能力，因為更換敷料時如果敷料黏附于傷口可能會引起患者的疼痛，而且對新生上皮也是一種損害[21]。

圖6 傷后各組創(chuàng)面愈合情況肉眼觀Fig.6 Gross appearances of eight groups of wound healing

圖7 各組感染創(chuàng)面愈合率比較Fig.7 Comparison of the wound healing rate of each groups

圖8 傷后第3天和第7天各組創(chuàng)面新生上皮長度(HE)Fig.8 Wound tissue sections obtained at day 3 and 7 post-wounding (HE)

圖9 傷后第3天和第7天各組再生上皮長度比較Fig.9 Comparison of the neo-epithelial length on day 3 and 7 post- wounding

本研究采用3D打印技術設計出能夠滿足不同傷口需求的iPDMS/AgNPs膜片，該膜片可以輕易地折疊和拉伸，表明其具有良好的彈性。另外，硅油修飾的PDMS膜片表面光滑無凸起，但納米銀點綴的iPDMS膜片表面有較為均勻的凸起存在，其平均直徑為14.8nm，該數(shù)值與納米銀的大小(＜100nm)一致[22]。此外，能譜觀察顯示，本研究制備的iPDMS/AgNPs含有1.1%銀元素，參考既往文獻和其他研究結(jié)果[22]，證實了納米銀的存在，表明成功制備了iPDMS/AgNPs納米銀復合材料。

圖10 傷后第7天各組創(chuàng)面肉芽組織厚度(HE)Fig.10 Wound tissue sections obtained at day 7 post-wounding (HE)

圖11 傷后第7天各組肉芽組織厚度比較Fig.11 Comparison of the thickness of granulation tissue on day 7 post- wounding

細胞毒性實驗顯示，不同納米銀濃度的iPDMS/AgNPs對培養(yǎng)1～7d的小鼠成纖維細胞增殖無明顯抑制作用。既往研究顯示納米銀的細胞毒性呈劑量依賴性，且低劑量時可能是無毒的[23]，本研究通過CCK-8實驗檢測發(fā)現(xiàn)，iPDMS/AgNPs對小鼠成纖維細胞沒有明顯的毒性作用，與Pauksch等[24]的研究結(jié)果一致，即納米銀在合適的濃度時無細胞毒性，僅在高濃度時有一定的細胞毒性作用。

抑菌的一個重要指標是細菌黏附和隨之而來的菌群形成，本研究應用臨床上常見的兩種標準耐藥菌(金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌)檢測iPDMS/AgNPs的抗黏附能力。結(jié)果顯示，硅油修飾的PDMS/AgNPs膜片細菌菌落數(shù)明顯少于其他各組，提示硅油修飾的膜片具有更好的抗黏附能力，該特點可能有助于提高創(chuàng)面的愈合率[25]。材料與細菌共培養(yǎng)結(jié)果顯示，納米銀修飾的膜片組OD值明顯低于其他各組，提示iPDMS/AgNP對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌具有較好的抗菌活性。上述結(jié)果表明iPDMS/AgNPs在體外能夠有效地抗感染，最終可能促進創(chuàng)面愈合，與Wu等[26]的研究結(jié)果一致，他們認為納米銀復合材料對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌具有良好的抗菌活性，其機制可能是納米銀可破壞金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的細胞壁結(jié)構(gòu)。

為了進一步探索iPDMS/AgNPs用做燒傷創(chuàng)面敷料的可行性，本研究采用小鼠全層皮膚感染創(chuàng)面模型觀察其對創(chuàng)面愈合率、新生上皮長度和肉芽組織厚度的影響。結(jié)果顯示，在傷后第3天和第7天，含有納米銀和硅油膜片組創(chuàng)面愈合率明顯高于空白組和PDMS組，表明iPDMS/AgNPs能有效提高創(chuàng)面愈合率，與既往研究結(jié)果一致[27]。病理組織學觀察顯示，應用iPDMS/AgNPs后，小鼠全層皮膚感染創(chuàng)面的再生上皮長度和肉芽組織厚度明顯增加，表明其可促進上皮再生和肉芽組織形成，從而加速創(chuàng)面愈合，與相關文獻報道一致[28-29]。

綜上所述，本研究設計了一種新的創(chuàng)面敷料iPDMS/AgNPs，不僅具有良好的生物相容性、柔韌性、抗黏附能力和抗菌活性，并能有效促進創(chuàng)面愈合，此外，該敷料采用3D打印機設計，可滿足不同患者的需求，有望在將來作為一種理想的創(chuàng)面敷料用于臨床。